מדגימת המעבדה למנה האנליטית: הכנה לפי ISO 6887, תרחיף ראשוני ואיחוד דגימות (pooling) לפתוגנים

השלב שאיש אינו רואה בדוח

תוצאה מיקרוביולוגית מדווחת כ"היעדר ב-25 גרם" או כ"3,200 CFU/g", אבל בין השקית שמגיעה למעבדה לבין הצלחת או המרק יש שלב שכמעט אף פעם אינו מופיע בדוח: הכנת הדגימה. כמה שוקלים, באיזה מדלל, כמה זמן מבצעים הומוגניזציה, כמה זמן התרחיף ממתין והאם מאחדים מנות: כל החלטה משנה את משמעות המספר. נטילת הדגימות במפעל מוסברת בדגימת משטחים וההעברה למעבדה בהובלה ושימור של דגימות; מאמר זה מתחיל במקום שבו הם מסתיימים, כשהדגימה כבר התקבלה.

הייחוס הבין-לאומי לשלב זה הוא סדרת ISO 6887 של הוועדה ISO/TC 34/SC 9. יש בה שישה חלקים: 6887-1:2017 קובע את הכללים הכלליים, וחמשת האחרים מיישמים אותם על קבוצות מוצרים: בשר (6887-2:2017), דגים ומוצרי דיג (6887-3:2017), מוצרים שונים כמו ביצים, ירקות, קקאו, עשבי תיבול ותבלינים (6887-4:2017), חלב ומוצרי חלב (6887-5:2020) ודגימות מהייצור הראשוני, מהחווה ועד בית המטבחיים (6887-6:2013). אם השיטה הספציפית למיקרואורגניזם כוללת הוראות משלה, הן קודמות.

התרחיף הראשוני 1:10, צעד אחר צעד

שקילה ויחס

ISO 6887-1 דורש לשקול או למדוד את המנה האנליטית בסבולת של ±5%, עם מינימום של 10 גרם או 10 mL אלא אם השיטה מורה אחרת, ולהוסיף פי 9 מכמות זו של מדלל, הנמדד רצוי לפי מסה בסבולת של ±2%. כך מתקבל המיהול 1:10. התקן מתיר יחסים אחרים כשיש בכך צורך: 1 ל-20, 1 ל-50 או 1 ל-100 למוצרים שנותנים תרחיפים סמיכים מדי, ו-1 ל-2 או 1 ל-5 כשמחפשים ספירות נמוכות, אם כי הוא מזהיר שהאחרונים עלולים להפר את היחס בין האינוקולום למצע ויש לאמת אותם לגופו של כל מקרה. כל יחס שאינו סטנדרטי עובר לחישוב הסופי.

מדללים

לשימוש כללי התקן מגדיר שני מדללים: תמיסת מלח פפטונית (1 גרם של עיכול אנזימטי של קזאין ו-8.5 גרם נתרן כלורי לליטר) ומי פפטון מבוקרי pH, שניהם עם pH סופי של 7.0 ± 0.2 ב-25 °C. קיימת גם גרסה בריכוז כפול של מי הפפטון מבוקרי ה-pH למוצרים חומציים מאוד. הנפח הסופי אינו יכול לסטות ביותר מ-±2%, והמדללים חייבים לעבור בדיקת ביצועים: לאחר 45 דקות עד שעה בטמפרטורת החדר, ספירת זן הבקרה צריכה להישאר בטווח של ±30% מהספירה ההתחלתית. דרישות הביצוע של מדללים ומצעים מפורטות ב-ISO 11133.

הומוגניזציה

התערובת עוברת הומוגניזציה לפי ISO 7218 (מהדורה רביעית, משנת 2024), בהומוגנייזר סיבובי (בלנדר מעבדה) או פריסטלטי, המכשיר עם המשוטים המכה בשקית סטרילית שבמעבדות נקרא לרוב סטומכר. אם צריך, משאירים את החלקיקים הגדולים לשקוע עד 15 דקות; שקיות עם מסנן מובנה הן חלופה שוות ערך. למוצרים קשים או יבשים, התקן מגביל את ההומוגנייזר הסיבובי ל-2.5 דקות רצופות ואת הקיצוץ או הטחינה המקדימים לדקה אחת, כדי למנוע את חימום הדגימה. המדריך של ה-FDA למזון (BAM, פרק 1) משתמש לספירות ב-50 גרם דגימה ב-450 mL של מדלל פוספט של Butterfield, בבלנדר במשך 2 דקות.

זמנים מרביים

ISO 6887-1 קובע שבין סיום הכנת התרחיף הראשוני למגע האינוקולום עם מצע הגידול הסופי לא יעברו יותר מ-45 דקות, ושבין התרחיף הראשוני לתחילת המיהולים לא יעברו יותר מ-30 דקות. אם המעבדה חמה מ-27 °C, יש לקצר את שני הזמנים. ה-BAM מחמיר יותר: לא יותר מ-15 דקות מההומוגניזציה ועד שכל המיהולים נמצאים במצעים שלהם. בתרחיף עשיר בחומרי מזון המיקרואורגניזמים עלולים להתחיל להתרבות, והתוצאה יוצאת גבוהה מהדגימה האמיתית.

מיהולים עשרוניים

בכל שלב עשרוני מעבירים 1 mL ± 0.02 mL למבחנה עם 9 mL ± 0.2 mL מדלל, בלי להחדיר את הפיפטה יותר מ-1 ס"מ, תוך ערבוב של 5 עד 10 שניות ועם קצה חדש בכל שלב.

כללים לפי סוג מזון

מוצרים קפואים

לאריזות קטנות (בדרך כלל פחות מ-2 ק"ג), ISO 6887-1 מתיר להביא אותן למרקם המאפשר לקחת את המנה, ב-18-27 °C לכל היותר 3 שעות או ב-5 ± 3 °C לכל היותר 24 שעות, ואינו ממליץ להפשיר באמבט מים או תחת זרם מים, בשל סכנת הזיהום אם האריזה אינה אטומה. ה-BAM מעדיף לא להפשיר, ואם צריך, מפשיר ב-2-5 °C לכל היותר 18 שעות, או מתחת ל-45 °C לא יותר מ-15 דקות תוך ניעור באמבט מבוקר טמפרטורה.

בשר

ISO 6887-2 מכסה בשר טרי, מקורר, קפוא, מוכבש, מותסס, טחון, תכשירי בשר, בשר שהופרד מכנית, בשר מבושל, מיובש ומעושן, תמציות מרוכזות ודגימות פגר שנלקחו בכריתה או במטוש. הוא מבחין, בין השאר, בין גושים ונתחים, נקניקים עם מעטפת ודגימות פני שטח או עומק. נטילת דגימות מהפגר היא עניינו של ISO 17604. ההקשר התעשייתי נמצא במיקרוביולוגיה בתעשיית הבשר.

מוצרי חלב

ל-ISO 6887-5 יש נהלים משלו לחלב נוזלי, אבקת חלב ומי גבינה, גבינות, קזאינים וקזאינטים (עם מקרה מיוחד לקזאין רנט), חמאה, גלידות, קינוחי חלב עם pH מעל 5, חלב מותסס ויוגורטים עם pH מתחת ל-5 ותמ"ל באבקה. ה-BAM ממחיש מדוע אי אפשר לטפל בהכול באותה דרך: ל-Salmonella בגבינה הוא מערבב בבלנדר 25 גרם עם 225 mL מרק לקטוז במשך 2 דקות, משאיר לעמוד 60 דקות ומכוונן את ה-pH ל-6.8 ± 0.2; אבקת חלב רזה אינסטנט, לעומת זאת, נשפכת בעדינות על פני המרק ונדגרת בלי ערבוב.

דגים ופירות ים

ISO 6887-3 כולל דגים שלמים או פילה, סרטנאים, דיונוניים, רכיכות דו-קשוותיות, חלזונות, מעטפתנים וקווצי עור, וכן מוצרים מעושנים, מבושלים וגושים קפואים, וכולל נהלים מיוחדים לרכיכות, למעטפתנים ולקווצי עור גולמיים מאזורי ייצור ראשוני.

מזונות יבשים, חומציים ושומניים

• לחות נמוכה: לשקול תחילה את המדלל ואחר כך להוסיף את המנה, כדי להפחית את ההלם האוסמוטי, ולהשרות עד שעה אם המוצר קשה. ה-BAM, לאבקות, מוסיף תחילה כ-15 mL מרק, יוצר תרחיף ללא גושים ומשלים את הנפח במנות.
• חומציים: התרחיף צריך לחזור ל-pH 7.0 ± 0.5. מי פפטון מבוקרי pH מספיקים למוצרים עם pH 4.5 ומעלה; בין pH 3.5 ל-4.5 אפשר להשתמש בגרסה בריכוז כפול, תוך בדיקת ה-pH בפעם הראשונה.
• שומניים (יותר מ-20%): אפשר להוסיף פוליסורבט 80 למדלל, בין 1 ל-10 g/L; בדרך כלל מספיק 1 g/L לכל 10% שומן.
• תבלינים מעכבים: ה-BAM מוסיף אשלגן סולפיט 0.5% לבצל ולשום מיובשים, ומדלל פלפל אנגלי, קינמון ואורגנו ל-1:100 וציפורן ל-1:1000, משום שאין דרך ידועה לנטרל את השפעתם.

דגימות מורכבות ודגימות מאוחדות: זה לא אותו דבר

איחוד יחידות מאותה אצווה חוסך עבודה וריאגנטים. תיקון 1 משנת 2024 ל-ISO 6887-1 מחדד שני מושגים שבפועל מתבלבלים ביניהם:

• דגימה מורכבת (composite): מערבבים כמה יחידות ומהתערובת לוקחים מנה בגודל שהשיטה מורה עליו, למשל 25 גרם. התוצאה ממשיכה להיות מבוטאת ב-25 גרם.
• דגימה מאוחדת (pooling): מאחדים כמה יחידות או מנות ומנתחים את התערובת כולה. התוצאה מבוטאת במסה הכוללת, למשל 100 גרם או 375 גרם.

אפשר לאחד מחוץ למעבדה, בצירוף דגימות בודדות לדגימה גדולה יותר, או בתוכה, בצירוף מנות להעשרה מקדימה גדולה אחת או בצירוף מרקים שכבר הועשרו. יש כללים נוקשים: רק לבדיקות איכותניות, רק עם יחידות מאותו מקור (אותה אצווה או משלוח) ובלי לשלב שתי שיטות בבת אחת, למשל לאחד מנות ואז לאחד גם את המרקים שלהן.

25 גרם או 375 גרם: מה משתנה כשמגדילים את המנה

המערך הקלאסי מגיע מה-BAM: מכל יחידת דגימה לוקחים מנה של 25 גרם, ועד 15 מנות אפשר לצרף לדגימה מורכבת של 375 גרם, שמנותחת כולה תוך שמירה על היחס 1:9 (375 גרם ב-3,375 mL מרק). מספר היחידות תלוי בקטגוריית המזון: 60 לקטגוריה I (ללא שלב קטלני ומיועד לקשישים, לחולים או לתינוקות), 30 לקטגוריה II ו-15 לקטגוריה III, כלומר 4, 2 או דגימה אחת של 375 גרם. תוצאה חיובית אחת פוסלת את האצווה. ה-BAM אינו כולל בהרכבה, בין היתר, אבקת חלב שאינה אינסטנט ואבקת חלב מלא.

התיקון משנת 2024 מציב תנאים טכניים כדי שהנפח הגדול לא יסתיר תוצאה חיובית:

• מרק ההעשרה המקדימה צריך להיות מחומם מראש לטמפרטורת הדגירה.
• יש להכיר את פרופיל הטמפרטורה של הנפח הגדול. אם לוקחים לדוגמה את ISO 6579-1, שההעשרה המקדימה שלו נמשכת בין 16 ל-20 שעות, התערובת צריכה להישאר בין 34 °C ל-38 °C במשך 16 שעות לפחות, ויש לצמצם ככל האפשר את הזמן עד להגעה לטמפרטורה זו.
• היחס בין הדגימה למדלל של השיטה המתוקפת אינו משתנה, אלא כדי להגדיל אותו במטריצות מעכבות כמו אבקת בצל, שום, אורגנו, פלפלים, תה וקפה מסוימים, תערובות ויטמינים או מוצרים מלוחים מאוד.
• דגימת מעבדה גדולה מהמרבי מחולקת: 750 גרם מעובדים כשתי מנות של 375 גרם.

בנוסף, הגודל המוגדל צריך להיות מתוקף. אם הוא תוקף במחקר לפי ISO 16140-2 או ISO 16140-5, כל מעבדה צריכה רק לאמת אותו לפי ISO 16140-3 בתוך אותה קטגוריית מזון; אם לא, עליה לתקף אותו בעצמה בפרוטוקול של נספח H לתיקון 1:2024 של ISO 16140-4, ולהראות באמצעות רמת הגילוי היחסית (RLOD) שה-LOD50 אינו מחמיר. לאחר תיקוף של 375 גרם, אפשר להשתמש במנות קטנות יותר באותו יחס. מושגים אלה מוסברים בתיקוף ואימות של שיטות.

הראיות תומכות בגישה כשהיא מבוצעת נכון. Tomás Fornés ועמיתיו תיקפו איחוד מנות עד 375 גרם ל-Salmonella בחמש שיטות (גידול, ELISA ו-PCR בזמן אמת) ב-23 מזונות (ממתקים, תמ"ל, מזון לחיות מחמד, משקאות באבקה ועוד). ב-22 מתוך 23 ה-RLOD50 מול 25 גרם היה קביל (פחות מ-2.5), בתנאי שהמרק חומם מראש וזמן הדגירה המרבי נשמר. האיחוד מופיע גם ברגולציה: תקנה (EC) 2073/2005 דורשת לאחד את עור הצוואר של לפחות שלושה פגרי עוף מאותה להקת מקור לדגימה של 26 גרם, ולאחד את המטושים מאתרים שונים בפגר לפני הניתוח. כיצד קוראים את n ו-c בתוכניות אלה מוסבר בתוכניות דגימה לפי מאפיינים, ומדוע שלב המרק מכריע, בהעשרה מיקרוביולוגית.

אילו ערכות ומצעים של TAAG קשורים לנושא

הערכה קובעת לאיזו מנה היא מתוקפת. בקטלוג של TAAG, Elevia 1.1 Salmonella spp. ‏(V-PAT04, RT-qPCR בטכנולוגיית AiGOR) מצהירה על רגישות של 1 CFU/375 g במזון ו-1 CFU/דגימה במשטחים; הסמכת AOAC שלה מכסה מנות של 375 g של שוקולד 62% קקאו, ליקר קקאו, אבקת חלב רזה ובוטנים, ו-TAAG מצהירה גם על מטריצות מתוקפות כגון שוקולד ממולא, בקר טחון (90% רזה), כדורי מזון לבעלי חיים, ביצים נוזליות מפוסטרות ומשטחי נירוסטה. דף הנתונים שלה מונה את התוסף Potentia 1 Salmonella spp. ‏(V-PET06), משפר צמיחה למי פפטון מבוקרי pH. Ampliora 1.1 Salmonella spp. ‏(V-SF97, PCR בזמן אמת) מצהירה על 1 CFU/25 g, עם מטריצות מתוקפות של ירך עוף גולמית, המבורגר בשר קפוא, נקניק מסוג לונגניסה, מורטדלה ומשטחים, ומשויכת ל-Augmentis 14 Universal Gram negative ‏(V-FL46, בקבוקים של 225 mL, נפח המרק ל-25 גרם ביחס 1:10). שימוש בערכה עם מנה, מטריצה או מערך איחוד שונים מאלה המוצהרים מחייב את האימות או התיקוף שדורש התיקון ל-ISO 6887-1. לבחירה לפי מטריצה, ראו כיצד לבחור ערכה של TAAG.