חלק מעמוד התווך של יסודות ותקינה במרכז הלמידה של TAAG. משלים את המדריך על הסמכת AOAC-PTM ואת זה על גידול מיקרוביולוגי מסורתי.
תוכן העניינים
שתי שאלות שונות על אותה שיטה
לפני שמשתמשים בשיטה מיקרוביולוגית בשגרה, מעבדה צריכה לענות על שתי שאלות. הראשונה היא האם השיטה פועלת: האם היא מגלה או מכמתת את המיקרואורגניזם המטרה בביצועים מקובלים ביחס לייחוס מוכר. השנייה היא האם היא פועלת בידיים שלה, עם הצוות, הציוד והמזונות שהיא מנתחת מדי יום. על השאלה הראשונה עונה הולידציה; על השנייה, האימות.
ההבחנה אינה טכנית בלבד. תקן ISO/IEC 17025:2017, השולט בכשירות מעבדות בדיקה, דורש שהמעבדה תאמת שהיא יכולה ליישם שיטה כהלכה לפני שהיא מכניסה אותה, תוך הוכחה שהיא משיגה את הביצועים הנדרשים ושמירת הרישומים. שיטה שעברה ולידציה ושאיש לא אימת במעבדה המשתמשת בה משאירה פער שמופיע בדרך כלל בביקורות. דרישות ההסמכה מפורטות במאמר על ISO/IEC 17025 במעבדות מזון.
ולידציה: קביעת ביצועי השיטה
הולידציה היא קביעת מאפייני הביצוע של שיטה ומתן ראיות אובייקטיביות לכך שהיא עומדת בדרישות לשימוש המיועד. במיקרוביולוגיה של מזון זה אומר, כמעט תמיד, להשוות שיטה חלופית (למשל ערכת PCR או מצע כרומוגני) לשיטת ייחוס, שהיא בדרך כלל פרוטוקול גידול מסורתי מתוקנן כמו ISO 6579-1 עבור Salmonella.
סדרת ISO 16140
הוועדה הטכנית ISO/TC 34/SC 9 החליפה את ISO 16140:2003 הישן בסדרת תקנים, שכל אחד מהם מיועד לתרחיש שונה:
- ISO 16140-1:2016: אוצר מילים משותף לולידציה.
- ISO 16140-2:2016: פרוטוקול לולידציה של שיטות חלופיות, ברובן מסחריות, מול שיטת ייחוס. יש לו תיקון שפורסם ב-2024 שתיקן חלק מהחישובים.
- ISO 16140-3:2021: פרוטוקול לאימות, במעבדה בודדת, של שיטות ייחוס ושיטות חלופיות שכבר עברו ולידציה.
- ISO 16140-4: ולידציה במעבדה בודדת. תוצאותיה תקפות רק למעבדה שביצעה את המחקר.
- ISO 16140-5: ולידציה פקטוריאלית בין-מעבדתית לשיטות לא מסחריות, עם פחות מעבדות משתתפות מאשר בחלק 2.
- ISO 16140-6:2019: ולידציה של שיטות חלופיות לאישור ולטיפוס, שיוצאות ממושבה חשודה ולא מדגימת מזון.
הסדרה מושלמת על ידי ISO 17468, הקובע את הדרישות הטכניות להקמה או לסקירה של שיטת ייחוס מתוקננת.
מה כוללת ולידציה לפי ISO 16140-2
לפרוטוקול שני שלבים. הראשון הוא מחקר השוואתי שמבוצע במעבדה מארגנת: מנתחים דגימות מזוהמות בשתי השיטות כדי למדוד את הרגישות, קובעים את רמת הגילוי היחסית (RLOD) ובודקים הכללה והדרה עם 50 זנים של המיקרואורגניזם המטרה ו-30 זנים שאינם מטרה. בשיטות כמותיות, המחקר ההשוואתי מעריך את הנכונות היחסית ואת פרופיל הדיוק. השלב השני הוא מחקר בין-מעבדתי, שבו מעבדות רבות מנתחות את אותן דגימות כדי להעריך את יכולת השחזור של השיטה.
היקף הולידציה תלוי בקטגוריות המזון שנחקרו. כדי להצהיר ששיטה תקפה ל"טווח רחב של מזונות" יש לכסות לפחות חמש קטגוריות. הצהרת היקף זו היא הדבר הראשון שכדאי לבדוק בתעודה.
מי מסמיך
באירופה, גופים עצמאיים כמו MicroVal, NF Validation (AFNOR) ו-NordVal (NMKL) מנפיקים תעודות המבוססות על ISO 16140-2 ומפרסמים את הדוחות באתריהם. בארצות הברית התוכנית הנפוצה ביותר היא של AOAC International, שהסברנו במדריך על הסמכת AOAC-PTM.
מה אומרת הרגולציה האירופית
תקנה (EC) 2073/2005 קובעת בסעיף 5 שלה שהשיטות האנליטיות שבנספח I הן שיטות הייחוס, ושהשימוש בשיטות חלופיות מקובל כשהן עברו ולידציה מול אותו ייחוס, ואם הן מסחריות, הוסמכו בידי צד שלישי לפי פרוטוקול EN ISO 16140 או פרוטוקולים דומים המקובלים בינלאומית. תקנה (EU) 2019/229 הוסיפה הגדרות מפתח: מה נחשב "טווח רחב של מזונות" ומהו גוף הסמכה עצמאי מיצרן השיטה.
אימות: הוכחה שהשיטה פועלת במעבדה שלכם
ISO 16140-3 מגדיר אימות כהוכחה ששיטה שעברה ולידציה פועלת בידי המשתמש בהתאם למפרטי הולידציה שלה. הוא מחלק את התהליך לשני שלבים.
שלב 1: אימות היישום
המעבדה מוכיחה שהיא יודעת לבצע את השיטה בעזרת מזון אחד, הנבחר מבין אלה שנותחו במחקר הולידציה. אם התוצאות דומות לאלה של הולידציה, הבעיה המהותית (הטכניקה) נפתרה.
שלב 2: אימות מזוני המעבדה
לאחר מכן המעבדה מוכיחה שהשיטה פועלת עם המזונות שהיא מצהירה שהיא מנתחת. לשם כך היא בוחרת מזון "קשה" מכל קטגוריה הכלולה בהיקפה: מוצרים עם פעילות מים נמוכה, עם חומרים אנטימיקרוביאליים טבעיים כמו תבלינים, עם לציטין, עם הרבה שומן. מדריך ההכשרה של ועדת ISO עצמה מציג דוגמאות כמו גלידה, אבקת ביצים, בשר מתובל ואבקת קקאו.
מה נמדד ובאיזה קריטריון קבלה
שיטות איכותניות: eLOD50
בשיטות גילוי מעריכים את רמת הגילוי ב-50% (eLOD50): הזיהום שבו השיטה נותנת תוצאה חיובית במחצית מהמנות שנותחו. היא נקראת "משוערת" משום שכמות הדגימות קטנה בהרבה מאשר בולידציה מלאה. קריטריון הקבלה הוא שה-eLOD50 שהושג לא יעלה על פי ארבעה מה-LOD50 של הולידציה. בדוגמה של מדריך ההכשרה של ISO עבור Salmonella לפי ISO 6579-1, ה-LOD50 של הייחוס היה 5.7 CFU, הגבול עמד על 22.8 CFU והמעבדה השיגה 3.0 CFU, ולכן עמדה בדרישה. מושג ה-LOD50 מפורט במאמר על גבול גילוי ואי-ודאות מדידה.
שיטות כמותיות: יכולת שחזור והטיה
בספירות, אימות היישום מודד את סטיית התקן של יכולת השחזור התוך-מעבדתית (SIR), בתכנון המתואם ל-ISO 19036. הקריטריון הוא שהיא לא תעלה על כפל הערך הממוצע הנמוך ביותר של יכולת שחזור שהושג בולידציה. אימות המזונות מודד את ההטיה המשוערת (eBias): מזהמים מנות בשלוש רמות, בכפילות, וההפרש מהרמה הצפויה אינו יכול לעלות על 0.5 log10 באף רמה.
שיטות אישור וטיפוס
כאן נדרש רק אימות היישום: בודקים זנים מטרה וזנים שאינם מטרה (בדוגמת המדריך, חמישה מכל סוג) ודורשים 100% התאמה לתוצאה הצפויה.
המועד של 2028 לשיטות ייחוס שלא עברו ולידציה
תקני ייחוס רבים של ISO פורסמו ללא נתוני ביצועים. עבורם, ISO 16140-3 מציע פרוטוקול מעבר בנספח F. לפי מסמך המעבר של ועדת ISO, ניתן להשתמש בנספח זה עד 31 בדצמבר 2027; החל מ-1 בינואר 2028, רק שיטות ייחוס שעברו ולידציה יוכלו לעבור אימות לפי ISO 16140-3. תקני ISO הם וולונטריים, אך גופי הסמכה נוטים לאמץ אותם כקריטריון.
אותו מסמך מבהיר מתי יש לאמת שוב. שיטה שכבר הוסמכה אינה זקוקה לאימות חדש אלא אם היא משתנה. שיטה חדשה או קטגוריית מזון חדשה בתוך ההיקף כן זקוקות לו. אם שיטה שעברה ולידציה עוברת שינוי טכני מהותי עם השפעה רלוונטית, גם כן.
אם האימות אינו עומד בדרישות
התקן מבקש ניתוח שורש הבעיה לפני החזרה. הסיבות הנפוצות הן הכנת הזריעה ורמתה, הומוגניזציית הדגימה, כיול ציוד, אצוות של מצעים או ריאגנטים ויישום הפרוטוקול בידי האנליסט. אם הבעיה נמשכת, הצעד הבא הוא להתייעץ עם ספק השיטה (אם היא מסחרית), עם גוף התקינה (אם היא שיטת ייחוס) או עם גוף ההסמכה.
טעויות נפוצות
- להניח שתעודת ולידציה מחליפה את האימות במעבדה.
- ליישם את השיטה על מזונות מקטגוריה שאינה בהיקף הולידציה שלה.
- לאמת רק עם מזון "קל" ולא עם מזון המייצג את הקשיים האמיתיים של המעבדה.
- לא לשמור את רישומי האימות, שהם נדרשים לפי ISO/IEC 17025.
- לשנות שלב בפרוטוקול, כמו זמן ההעשרה, ולהמשיך להתייחס לשיטה כאל שעברה ולידציה.
סיכום
ולידציה ואימות עונים על שאלות שונות: האם שיטה פועלת והאם היא פועלת במעבדה שלכם. סדרת ISO 16140 מסדרת את שני התהליכים, מהולידציה של שיטות חלופיות לפי ISO 16140-2 ועד האימות במעבדה בודדת לפי ISO 16140-3, עם קריטריוני קבלה קונקרטיים כמו ה-eLOD50 או ה-eBias. בדיקת היקף התעודה, אימות עם מזונות מייצגים ושמירת הרישומים מונעים משיטה שעברה ולידציה היטב להפוך לנקודת תורפה של המעבדה.
על TAAG
גלו כיצד TAAG מתעדת את ההיקף המאומת של ערכות הגילוי המולקולריות שלה כדי להקל על אימותן במעבדה של כל לקוח.
שאלות נפוצות
מה ההבדל בין ולידציה לאימות של שיטה מיקרוביולוגית?
הולידציה קובעת את ביצועי השיטה ומוכיחה שהיא מתאימה לשימוש מיועד, בדרך כלל בהשוואה לשיטת ייחוס. האימות מוכיח שמעבדה מסוימת משיגה את הביצועים האלה כשהיא מיישמת אותה עם הציוד, הצוות והמזונות שלה.
האם שיטה עם תעודת MicroVal, NF Validation או AOAC צריכה אימות?
כן. התעודה תומכת בשיטה, אך ISO/IEC 17025 דורש שכל מעבדה תאמת שהיא יכולה ליישם אותה כהלכה לפני שהיא משתמשת בה, ו-ISO 16140-3 מתאר כיצד לעשות זאת.
מהו ה-eLOD50?
זוהי רמת הגילוי ב-50% המשוערת בזמן אימות שיטה איכותנית: הזיהום שבו השיטה מגלה את המיקרואורגניזם במחצית מהמנות שנותחו. ISO 16140-3 מקבל את התוצאה אם היא לא עולה על פי ארבעה מה-LOD50 שהושג בולידציה.
מה קורה עם שיטות ייחוס של ISO שאין להן נתוני ולידציה?
עד 31 בדצמבר 2027 ניתן לאמת אותן בפרוטוקול המעבר שבנספח F של ISO 16140-3. החל מ-1 בינואר 2028, רק שיטות ייחוס שעברו ולידציה יוכלו לעבור אימות לפי תקן זה.