המספר הסביר ביותר (MPN): כיצד השיטה פועלת, כיצד קוראים את הטבלאות ומתי להעדיף אותה על ספירה בצלחת

לספור בלי לראות מושבות

ספירה בצלחת סופרת את מה שנראה לעין: כל מושבה על האגר נחשבת ליחידה יוצרת מושבה, כפי שמוסבר במהן יחידות CFU וכיצד מפרשים אותן. שיטת המספר הסביר ביותר (MPN, Most Probable Number) מגיעה למספר בדרך אחרת. היא אינה סופרת מושבות: היא מחלקת את הדגימה לכמה מבחנות עם מרק, בודקת באילו יש צמיחה, ומתוך הצירוף הזה של חיוביים ושליליים מחשבת את הריכוז שבסבירות הגבוהה ביותר הוביל לתוצאה.

נספח 2 של המדריך האנליטי הבקטריולוגי (BAM) של ה-FDA מייחס ל-McCrady, ב-1915, את ההערכה המדויקת הראשונה של חיידקים חיים בדרך זו. השיטה עדיין בשימוש משום שהיא פותרת מצבים שבהם הצלחת נכשלת: ריכוזים נמוכים, מזונות עם חלקיקים שמתבלבלים עם מושבות, ומיקרואורגניזמים שזקוקים להעשרה לפני שאפשר לבודד אותם.

העיקרון הסטטיסטי

הרעיון הוא למהול עד שחלק מהמבחנות יקבלו לפחות תא חי אחד ואחרות אף לא אחד. אם החיידקים מפוזרים באקראי, מספר התאים שנופל בכל מבחנה מתפלג לפי התפלגות פואסון, וההסתברות שמבחנה תישאר ללא תאים תלויה רק בריכוז ובכמות הדגימה שהוכנסה. עם כמה מיהולים עשרוניים וכמה מבחנות לכל מיהול, דפוס המבחנות החיוביות מאפשר להעריך את הריכוז המקורי. ה-MPN הוא, פשוטו כמשמעו, ערך הריכוז שהופך את התוצאה שנצפתה לסבירה ביותר; את המשוואה פותרים באיטרציה.

ההנחות שחייבות להתקיים

ה-BAM מונה ארבעה תנאים כדי שההערכה תהיה תקפה:

• החיידקים מפוזרים באקראי בדגימה.
• הם נפרדים זה מזה, אינם מקובצים, ואינם דוחים זה את זה.
• כל מבחנה שמקבלת ולו אורגניזם חי אחד מראה צמיחה או שינוי הניתן לגילוי.
• המבחנות בלתי תלויות זו בזו.

ההנחה השלישית היא התובענית ביותר: המצע חייב לאפשר צמיחה של תא בודד, לעיתים פגוע, מול הפלורה הנלווית. לכן איכות המרק ושלב ההעשרה קובעים ישירות את התוצאה. בנוסף, ה-MPN סופר רק אורגניזמים חיים. אם החיידקים יוצרים שרשראות או צברים שהמיהול אינו מפריד, ה-BAM מציין שיש לקרוא את התוצאה כיחידות צמיחה או CFU, לא כתאים בודדים.

סדרות של 3, 5 ו-10 מבחנות

התכנון הנפוץ ביותר בספרות הוא שלושה מיהולים עשרוניים עוקבים עם 3, 5, 8 או 10 מבחנות בכל אחד; נספח 2 כולל טבלאות לתכנונים אלה, שנבנו עבור תרכיבים של 0.1, 0.01 ו-0.001 g. פרק 4 של ה-BAM, על קוליפורמים ו-E. coli, מציין שסדרת 3 המבחנות משמשת לרוב המזונות; שברכיכות דו-קשוותיות אין להשתמש בפחות מ-5 מבחנות לכל מיהול; ושקיימת שיטה של 10 מבחנות למים בבקבוקים או לדגימות שאינן צפויות להיות מזוהמות מאוד.

יותר מבחנות פירושן יותר מידע לכל מיהול, ולכן רווחים צרים יותר וגבול תחתון נמוך יותר. עם טבלאות ה-BAM והתרכיבים של 0.1, 0.01 ו-0.001 g, תוצאה שבה כל המבחנות שליליות מדווחת כקטנה מ-3.0 MPN/g בסדרת 3 המבחנות וכקטנה מ-1.8 MPN/g בסדרת 5 המבחנות. הגבול העליון של רווח הסמך לתוצאה האפסית הזו יורד מ-9.5 ל-6.8, ועם 10 מבחנות ל-3.1 MPN/g.

כיצד קוראים את הטבלאות

התוצאה מבוטאת כקוד בן שלוש ספרות: מספר המבחנות החיוביות בכל אחד משלושת המיהולים שנבחרו. בטבלת 3 המבחנות, הקוד 3-1-0 מתאים ל-43 MPN/g, עם רווח סמך של 95% בין 9 ל-180. אם התרכיבים שהשתמשו בהם היו קטנים פי עשרה מאלה שבטבלה (0.01, 0.001 ו-0.0001 g), מכפילים את הערך ואת גבולותיו ב-10: ‏430 MPN/g. אותו כלל פועל גם בכיוון ההפוך: הכנסת כמויות גדולות יותר מורידה את גבול הכימות.

כאשר זורעים יותר משלושה מיהולים, ה-BAM מתאר נוהל לבחירת השלושה שמועברים לטבלה. בתמצית, משמיטים את המיהולים הגבוהים ביותר שיחד עם המיהול שלפניהם כל המבחנות בהם שליליות, ומחפשים את המיהול הגבוה ביותר שבו כל המבחנות חיוביות. ה-FDA מציע גם יישום לחישוב וגיליון אלקטרוני לבחירת מיהולים.

הטבלאות משמיטות צירופים בלתי סבירים כל כך שהם מרמזים על טעות מעבדה או על זיהום. אם הקוד שהתקבל אינו מופיע בטבלה, ה-BAM מתייחס אליו כתוצאה בלתי סבירה: היא עשויה לנבוע מהפרעות במיהולים הנמוכים או מאישור של מעט מושבות, ואם הסיבה אינה ידועה, ייתכן שההערכה אינה אמינה.

רווחי סמך: המספר מגיע עם טווח רחב

תמיד יש לקרוא MPN יחד עם רווח הסמך שלו. בסדרת 5 המבחנות, הקוד 5-2-0 נותן 49 MPN/g עם רווח של 95% בין 15 ל-150: הערך האמיתי יכול להימצא בטווח שמשתרע על פני פקטור של קרוב לעשרה. ה-BAM מגדיר את הרווח כך: לפני שזורעים את המבחנות, ההסתברות שהרווח שיתקבל יכיל את הריכוז האמיתי היא לפחות 95%. הטבלאות משתמשות בגרסה מותאמת של שיטת de Man ‏(1983); גיליון ה-Excel של ה-FDA משתמש בקירוב נורמלי ללוגריתם של ה-MPN, ולכן הרווחים שלו עשויים שלא להתאים לאלה שבטבלאות.

כמה חוקרים תיארו נטייה של ה-MPN להעריך את הריכוז ביתר. ה-BAM מצטט את עבודתו של Garthright ‏(1993), שהראה שההטיה הזו אינה משמעותית כאשר התוצאות מבוטאות בלוגריתמים, הצורה המקובלת להשוות ולשלב נתונים. כדי להבין כיצד משתלבים אי-הוודאות, גבול הגילוי והחלטת העמידה בדרישות, ראו גבול גילוי ואי-ודאות מדידה.

היכן משתמשים ב-MPN בתעשיית המזון

קוליפורמים ו-E. coli במזון

לשיטה הקלאסית של ה-BAM שלושה שלבים. בשלב המשוער זורעים את המיהולים במרק לאוריל טריפטוז (LST) ומדגירים ב-35 °C; רושמים ייצור גז לאחר 24 ו-48 שעות. בשלב המאשר לקוליפורמים, כל מבחנה עם גז מועברת למרק Brilliant Green Lactose Bile ‏(BGLB) ב-35 °C, ולקוליפורמים צואתיים ול-E. coli למרק EC ב-44.5 °C. השלב המלא ל-E. coli מוסיף בידוד על אגר L-EMB ובדיקות ביוכימיות (IMViC). ה-MPN מחושב לפי שיעור המבחנות המאושרות בשלושה מיהולים עוקבים. הפרק מזכיר שקוליפורם אינו קטגוריה טקסונומית אלא הגדרת עבודה. מה מציינת כל קבוצה במים מוסבר בקוליפורמים כלליים, E. coli ואנטרוקוקים.

E. coli ברכיכות דו-קשוותיות: ISO 16649-3

זה המקרה שבו ה-MPN הוא השיטה שהתקן עצמו קובע. תקנה (EC) 2073/2005 קובעת לרכיכות דו-קשוותיות חיות, ולקווצי עור, מעטפתנים וחלזונות ימיים חיים, קריטריון בטיחות ל-E. coli עם n = 5, ‏c = 1, ‏m = 230 ו-M = 700 MPN ל-100 g בשר ונוזל בין-קשוותי, לאורך חיי המדף, עם EN/ISO 16649-3 כשיטת הייחוס. המנה משביעת רצון אם חמשת הערכים הם 230 או פחות, או אם רק אחד מהם נמצא בין 230 ל-700.

הפרוטוקול הגנרי של מרכז הייחוס של ה-FAO, המבוסס על ISO 16649-3, מתאר את השיטה כ-MPN דו-שלבי עם 5 מבחנות ו-3 מיהולים. תחילה זורעים את ההומוגנט של הרכיכה במרק גלוטמט עם מינרלים מותאם ומדגירים ב-37 °C במשך 24 שעות; לאחר מכן מעבירים את המבחנות שבהן נוצרה חומצה לאגר עם מצע כרומוגני של β-גלוקורונידאז (TBX) ב-44 °C. גבול הגילוי התאורטי הוא 18 E. coli ל-100 g, ועם שלושה מיהולים התוצאה המרבית הניתנת לדיווח היא גדולה מ-18,000. זנים שליליים ל-β-גלוקורונידאז, כמו E. coli O157, אינם מתגלים. אותו מסמך מציין שתקן ה-Codex ‏292-2008 מזהה שיטה זו, או שיטה שוות ערך, לרכיכות דו-קשוותיות חיות או טריות.

Salmonella כמותית בפגרים ובעור צוואר

עבור Salmonella, הגילוי (היעדר ב-25 g) עונה על השאלה אם הפתוגן קיים; ה-MPN עונה כמה ממנו יש. המפרט הטכני ISO/TS 6579-2:2012 מתאר MPN ממוזער בצלחות של 12 בארות: שלוש בארות לכל מיהול, מיהולים עוקבים במי פפטון מבוּפרים והעברה למצע חצי-מוצק MSRV ב-41.5 °C, עם אישור על אגר XLD. התקן מכיר במגבלה שלו: גבול הגילוי הוא כ-1 CFU/g, לעומת 1 CFU ב-25 g ‏(0.04 CFU/g) בשיטת הגילוי, והוא אינו מתאים לדגימות עם פחות מ-1 CFU/g, שעבורן הוא ממליץ על MPN קונבנציונלי.

מחקר שפורסם ב-Poultry Science ב-2024 יישם את ה-MPN הממוזער הזה על 96 דגימות מורכבות של עור צוואר, שייצגו 480 פגרי עוף. הוא מצא Salmonella ב-97.9% מהדגימות לפני הקירור וב-85.4% אחריו, עם ספירות ממוצעות של 1.84 ו-1.48 log MPN/g. תוצאת נוכחות בלבד לא הייתה מראה את הירידה הזו. כימות מסוג זה משמש להערכת שלבי תהליך, כפי שמוצג בSalmonella בבשר עוף.

Listeria monocytogenes בדגימות חיוביות

פרק 10 של ה-BAM דורש לספור L. monocytogenes כאשר מזון נמצא חיובי, באמצעות מנת שמורה ובשילוב של MPN וזריעה ישירה. ה-MPN נבנה עם 50 g דגימה ב-450 ml מרק העשרה מבוּפר ל-Listeria ‏(BLEB) וארבעה מיהולים עם שלוש מבחנות כל אחד, השקולים ל-10, 1, 0.1 ו-0.01 g דגימה. לאחר 48 שעות זורעים כל מבחנה לבידוד ולאישור, או סורקים אותה בשיטה מהירה מאושרת ומאשרים את המשוערים; את התוצאה מפרשים לפי הטבלאות של נספח 2. אם כל המבחנות חיוביות, הספירה בזריעה ישירה היא הקובעת.

MPN מול ספירה בצלחת (CFU)

אין אלה שיטות מתחרות, אלא כלים לטווחים ולמטריצות שונים:

• רגישות בספירות נמוכות. ה-BAM מציין שה-MPN שימושי במיוחד לריכוזים נמוכים, פחות מ-100 לגרם, בעיקר בחלב ובמים. כל מבחנה יכולה לקבל כמה גרמים, מה שמוריד את הגבול התחתון.
• מטריצות קשות. במזונות עם חלקיקים שמפריעים לספירת מושבות, המבחנה עם המרק חוסכת את הצורך להבחין בין מושבות לשאריות מזון.
• התאוששות של תאים פגועים. המרק משמש שלב צמיחה מקדים, דבר שמיטיב עם תאים שעברו עקה מחום, מקור או מחומרי חיטוי, בתנאי שהמצע מתאים.
• דיוק. זו נקודת החולשה: רווחי ה-MPN רחבים, כך ששתי תוצאות שנראות שונות עשויות שלא להיבדל סטטיסטית. צלחת שנספרה היטב בטווח השימושי שלה מדויקת יותר, ככלל.
• עבודה וזמן. מבחנות רבות, כמה העברות ואישורים של 48 שעות ויותר. הגידול המסורתי בצלחת ישיר יותר כאשר העומס הצפוי גבוה.
• אישור. בשיטות לפתוגנים, מבחנה עם צמיחה היא משוערת עד שהיא מאושרת (ראו תוצאה משוערת מול מאושרת).

אילו ערכות של TAAG קשורות לשיטה זו

ל-TAAG אין ערכת MPN: ערכות ה-PCR בזמן אמת שלה הן איכותניות (גילוי וזיהוי) ואינן מספקות מספר מיקרואורגניזמים לגרם. התפקיד האפשרי שלהן הוא בקריאת המבחנות או הבארות, כפי שפרק 10 של ה-BAM מתיר ל-MPN של Listeria. בקטלוג יש ערכות למיקרואורגניזמים שמכמתים ב-MPN: Specio 1.3 E. coli ‏(V-SF167), עם מטריצות מוצהרות של מזון, משקאות ומשטחים חיים ודוממים; Ampliora 1.3 E. coli ‏(V-SF69), לירקות עלים ולמשטחים; Ampliora 1.1 Salmonella spp. ‏(V-SF97), עם רגישות מוצהרת של 1 CFU/25 g בירך עוף נא, המבורגר בקר קפוא, נקניקייה (longanicilla), מורטדלה ומשטח; ו-Ampliora 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes ‏(V-SF46), למזון, משקאות ומשטחים. אף אחת מהן אינה מצהירה על רכיכות דו-קשוותיות כמטריצה מתוקפת, ומצעי ההעשרה הנלווים להן אינם המרקים של MPN מתוקנן (MMGM, ‏BLEB או MSRV). שימוש בערכה לקריאת מבחנות MPN מחייב לתקף את השימוש הזה עם המרק והמטריצה הספציפיים; כדאי לבדוק זאת עם TAAG לפני שמשלבים אותה בנוהל.