اختبارات الكفاءة والمقارنات بين المختبرات في ميكروبيولوجيا الأغذية: ماذا تشترط المعايير وكيف تُقرأ درجة z

ما اختبار الكفاءة وبمَ يختلف عن المقارنات الأخرى

قد يحمل مختبر ذو طرق مصادق عليها ومحللين مدرَّبين انحيازًا لا يكشفه أحد من الداخل. والسبيل إلى رؤيته مقارنة نتائجه بنتائج مختبرات أخرى تحلل المادة نفسها. ويعرّف ISO/IEC 17043:2023 المقارنة بين المختبرات بأنها تنظيم قياسات أو اختبارات على مواد متماثلة أو متشابهة يجريها مختبران أو أكثر وتنفيذها وتقييمها وفق شروط محددة مسبقًا. واختبار الكفاءة (بالإنجليزية proficiency testing أو PT) حالة خاصة منها: يقيّم أداء كل مشارك مقابل معايير محددة سلفًا، بواسطة مقارنة بين المختبرات.

وليست كل مقارنة تقيّم المختبر. فالدراسة بين المختبرات للحصول على خصائص أداء طريقة ما، مثل دراسات سلسلة ISO 16140 الموصوفة في المصادقة على الطرق الميكروبيولوجية والتحقق منها، تقيس الطريقة لا المشارك.

ماذا يشترط ISO/IEC 17025

يطلب البند 7.7 من ISO/IEC 17025:2017 إجراءً لضمان صحة النتائج. ويجمع البند الفرعي 7.7.1 التدابير الداخلية (المواد المرجعية، والضوابط، والتكرارات، والمقارنة بين المحللين)، ويضيف 7.7.2 النظرة الخارجية: إذ يجب على المختبر متابعة أدائه بمقارنته بنتائج مختبرات أخرى، عبر اختبارات الكفاءة أو مقارنات أخرى بين المختبرات، حين تكون متاحة وملائمة. والإطار العام للاعتماد في اعتماد ISO/IEC 17025 في مختبرات الأغذية.

وتنزّل سياسة ILAC-P9:01/2024، التي تطبقها هيئات الاعتماد الموقِّعة على اتفاق الاعتراف المتبادل لـ ILAC، هذا المتطلب إلى قواعد محددة:

• تُعدّ المشاركة إلزامية حين يكون اختبار الكفاءة متاحًا وملائمًا ويُرى ضروريًا وفق تحليل المخاطر الخاص بالمختبر.
• يجب أن تكون لدى المختبر خطة مشاركة، وتقيّمها هيئة الاعتماد قبل منح الاعتماد للتحقق من أنها تغطي النطاق تغطيةً تمثيلية.
• حين لا يكون الأداء مرضيًا، تقيّم الهيئة أدلة الإجراءات التصحيحية السريعة والملائمة.

مستوى المشاركة وتكرارها

لا أحد يشارك في اختبار لكل تركيبة من الطريقة والمادة المحلَّلة والمصفوفة. وتقترح ILAC-P9، متبعةً الدليل EA-4/18 G:2021، تجميع النطاق في مجالات كفاءة تقنية: تركيبات من التقنية والخاصية والمنتج متكافئة بما يكفي لأن تمثل نتيجة إحداها البقية. ونادرًا ما يتسع مجال واحد لتقنيات مختلفة؛ أما المنتجات المختلفة فنعم، إذا كانت المصفوفات متكافئة الطبيعة. ويحدد المختبر التكرار الأدنى لكل مجال بحسب المخاطر: حجم التحاليل، ودوران الموظفين وخبرتهم، واستقرار المادة المحلَّلة والمصفوفة، ومتانة الطريقة، والاستخدام النهائي للبيانات. ويذكر الدليل سلامة الأغذية ضمن المجالات التي تتطلب مستوى عاليًا من الضمان.

المعايير الثلاثة التي يستند إليها اختبار الكفاءة في الميكروبيولوجيا

ISO/IEC 17043:2023: كفاءة المزوّد

يحدد متطلبات الكفاءة والحياد لمزوّدي اختبارات الكفاءة. وقد حلت الطبعة الثانية، الصادرة في مايو 2023، محل طبعة 2010، التي ظلت صالحة بحسب ILAC-P9 حتى مايو 2026. والسؤال العملي للمشارك هو ما إذا كان المزوّد معتمدًا وفق هذا المعيار من هيئة موقِّعة على اتفاق ILAC، وهي الطريقة المعترف بها لإثبات كفاءته.

ISO 13528:2022: الإحصاء

يصف الطرق الإحصائية لتصميم المخططات وتحليل بياناتها، ويقدم توصيات لتفسير النتائج، الكمية منها والنوعية. والطبعة الثالثة صادرة في أغسطس 2022 ولها تعديل نُشر عام 2026. وفيها طرق تحديد القيمة المسندة (القيمة المرجعية للجولة)، والانحراف المعياري لتقييم الكفاءة (σ_pt، الذي يحدد القدر المسموح به من التفاوت)، ودرجات الأداء.

ISO 22117:2019: ما يخص الميكروبيولوجيا

حل محل المواصفة التقنية ISO/TS 22117:2010 وأُكِّد في مراجعته الدورية. ويضع متطلبات وإرشادات لتنظيم مخططات اختبارات الكفاءة في ميكروبيولوجيا الأغذية والمشروبات، والأعلاف، والعينات البيئية من إنتاج الأغذية والأعلاف وتداولها، والإنتاج الأولي؛ وكذلك المياه المستخدمة في إنتاج الأغذية أو التي تعدّها التشريعات الوطنية غذاءً. ويغطي التنظيم التقني للمخطط والمعالجة الإحصائية للنتائج، وهو مصمم للاستخدام مع ISO/IEC 17043 وISO 13528: فلا يضيف إلا ما تحتاجه الميكروبيولوجيا زيادةً على ذلك. ومن الأمثلة تحضير المادة: فقد تحقق مخطط أُجري عام 2021 في الهند لـ Listeria monocytogenes وSalmonella في روبيان مجفَّد من تجانس المادة واستقرارها أثناء التخزين (حتى 28 يومًا) والنقل (حتى 6 أيام) قبل إرسالها.

كيف تُقرأ درجة z

الدرجة الأكثر استخدامًا هي درجة z (z-score): z = (x_i − x_pt) / σ_pt، حيث x_i نتيجة المختبر، وx_pt القيمة المسندة، وσ_pt الانحراف المستخدم للتقييم. والتفسير المعتاد، المأخوذ من ISO 13528 والوارد في دليل Eurachem لعام 2021، هو:

• |z| ≤ 2,0: أداء مرضٍ، دون إشارة.
• 2,0 < |z| < 3,0: أداء مشكوك فيه، إشارة تحذير.
• |z| ≥ 3,0: أداء غير مرضٍ، إشارة إجراء.

مثال توضيحي: إذا كانت القيمة المسندة لعدّ ما 4,20 log CFU/غ، وσ_pt تساوي 0,25 log، وأبلغ المختبر 4,85 log CFU/غ، فإن z = 0,65 / 0,25 = 2,6: أداء مشكوك فيه. وما تمثله وحدة CFU وكيف يُفسَّر العدّ يُشرح في ما وحدات تشكيل المستعمرات.

وهناك تنبيهان. أولًا، تتوقف درجة z على σ_pt: فكلما كبرت صغرت z وبدا الأداء أفضل، لذا يحسن التحقق مما إذا كانت هذه القيمة منطقية بالنسبة لاستخدام المختبر لنتائجه. ثانيًا، لا تأخذ درجة z في الحسبان عدم اليقين في القيمة المسندة. فإذا كان عدم اليقين المعياري هذا أقل من 0,3·σ_pt، يُعدّ مهملًا؛ وإلا فعلى المزوّد استخدام طريقة أخرى لتحديد القيمة المسندة، أو درجات تدمجه مثل z′ أو زيتا (ζ)، أو إبلاغ المشاركين. وتُتناول العلاقة بين هذه الدرجات وعدم اليقين الخاص بالمختبر في حد الكشف وعدم اليقين في القياس.

الاختبارات النوعية: حين تكون النتيجة «كُشف» أو «لم يُكشف»

معظم تحاليل الممرضات تحاليل وجود أو غياب، ولا معنى فيها لحساب المتوسطات أو الانحرافات. ويتيح ISO 13528 تحديد القيمة المسندة بالتحضير المعروف للمادة، أو بالمواد المرجعية، أو بحكم الخبراء، ويُقيَّم الأداء بمعايير الإصابة في العينات الموجبة والسالبة. ويبيّن اختبار عام 2024 لمختبر الاتحاد الأوروبي المرجعي لـ Salmonella، الذي يستند تصميمه العام إلى ISO 22117، كيف يجري ذلك:

• شارك 68 مختبرًا مرجعيًا وطنيًا، حللت بـ EN ISO 6579-1 مسحات قماشية ملوثة بـ S. Typhimurium بمستويات مختلفة وعينات غير ملوثة.
• اشترط معيار الأداء الجيد 2 موجبة على الأقل من 3 في المستوى العالي (37,5 CFU لكل عينة)، و2 على الأقل من 4 في المستوى المنخفض (4,5 CFU لكل عينة)، و0 موجبة من 3 في العينات السالبة.
• استوفى خمسة وستون مختبرًا المعيار. وأخفق مختبر واحد في المستوى المنخفض، لكنه أثبت قدرته بعينات ذات مستوى منخفض جدًا إضافي فتحول تصنيفه إلى أداء متوسط. ولم يُقيَّم مختبران آخران لأن الطرد استغرق 25 يومًا للوصول ولم يكن من الممكن ضمان بقاء البكتيريا حية.

وفي هذه النقطة الأخيرة درس: فالنتيجة السيئة قد ترجع إلى المادة لا إلى المختبر. وفي الجولتين المذكورتين في الهند، حصل نحو 16 % من المختبرات في كل جولة على نتائج غير مرضية، معظمها بسبب نتائج موجبة كاذبة. وأشار المؤلفون إلى أسباب محتملة هي إعادة تكوين العينة بطريقة خاطئة أو عدم كفاية الوقت بين إعادة التكوين والتحليل، والأخطاء التشغيلية، والتلوث المتبادل، والإخفاق في تحديد المستعمرات النموذجية أو تأكيدها. ويتصل هذا الأخير بما يُشرح في النتيجة المفترضة مقابل المؤكدة. وفي فرنسا، نظمت المختبرات المرجعية الوطنية بين 2019 و2021 مخططًا مشتركًا للمختبرات الرسمية، بمتوسط 65 مشاركًا سنويًا.

ماذا يُفعل أمام نتيجة مشكوك فيها أو غير مرضية

دليل Eurachem واضح في المبدأ: يجب التحقيق في كل نتيجة غير مرضية وتوثيقها، ويُسجَّل التقييم حتى إن تقرر عدم اتخاذ إجراءات. فنتيجة سيئة واحدة لا تثبت أن المختبر غير كفء، لكن الأداء السيئ المتكرر يدل على مشكلة جدية، وعندها ينبغي للمختبر أن ينظر في التوقف عن تقديم ذلك الاختبار حتى يحلها. ويُدار التحقيق ضمن إجراء حالات عدم المطابقة في المختبر. وترتيب عملي لذلك:

• مراجعة التقرير. التأكد من أن النتائج المنشورة هي التي أُرسلت، وفهم كيفية حساب الدرجة.
• استبعاد الأخطاء الإدارية. النسخ، والترقيم، والكسور العشرية، أو الوحدات. وإذا تكررت، فالمشكلة في نظام الإدارة لا في التقنية.
• مراجعة الجانب التقني. تخزين المادة وإعادة تكوينها، وبيانات الضبط الداخلي للتشغيل، والمعدات والكواشف والمعايرة، والظروف البيئية، ومعالجة البيانات. وفي الميكروبيولوجيا يشمل ذلك مراقبة أداء الأوساط الموصوفة في مراقبة جودة الأوساط وفق ISO 11133، وإذا استُخدم PCR، الضوابط المشروحة في ضوابط PCR.
• مراجعة المخطط. اختلافات المصفوفة عن عينات الروتين، وتلف المادة، ومستويات خارج نطاق الطريقة، وقيمة مسندة أو σ_pt غير ملائمتين، ومجموعة مقارنة مختارة اختيارًا سيئًا، أو أخطاء المزوّد.
• إغلاق الحلقة. تحليل السبب بالبيانات الخام والجولة كاملة والجولات السابقة والضبط الداخلي؛ وتخطيط الإجراء التصحيحي وتنفيذه وتسجيله، والتحقق من فعاليته، ويُفضَّل أن يكون ذلك بمشاركة جديدة.

وبالنسبة للنتائج المشكوك فيها، يقترح Eurachem تحديد متى يُحقَّق فيها: مثلًا عند تكرار الدرجات المشكوك فيها أو توالي نتائج بالإشارة نفسها للانحياز.

كيف يُستفاد منه

يجب معاملة المادة كعينة روتينية: الطريقة نفسها، ومسار العمل نفسه، والمحللون الذين يعالجون العينات المعتادة. ويحسن اختيار مخططات تشبه مصفوفتها ومستواها الروتين، والإبلاغ عن الطريقة المستخدمة؛ ففي الاختبار الأوروبي لعام 2024، أبلغ عشرون مختبرًا أيضًا عن نتائج طريقة ثانية.

ما علاقة مجموعات TAAG باختبارات الكفاءة

لا تنظم TAAG اختبارات كفاءة ولا تنتج مواد لها. لكن المختبر الذي يستخدم مجموعة من TAAG في روتينه يجب أن يغطي هذه الطريقة في خطة مشاركته. ومن أمثلة الكتالوج Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97، PCR في الزمن الحقيقي بمسابير متألقة، تصميم بـ Mila)، بحساسية معلنة قدرها 1 CFU/25 غ ومصفوفات مصادق عليها هي فخذ الدجاج النيئ وبرغر لحم البقر المجمد ونقانق لونغانيسيا والمورتاديلا والسطح، وSpecio 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF04، PCR في الزمن الحقيقي بمنحنى الانصهار)، بحساسية معلنة قدرها 1 CFU/25 غ في الأغذية ومصفوفات معلنة هي الأغذية والمشروبات والأسطح الحية والخاملة. وكلتاهما نوعيتان: فالنتيجة الموجبة مفترضة حتى تُؤكَّد. ولا يسجل الكتالوج شهادات من أطراف ثالثة لهاتين المجموعتين، ولذلك فإن النتيجة الجيدة في اختبار الكفاءة تثبت أداء المختبر بهذه الطريقة، لكنها لا تحل محل المصادقة مقابل الطريقة المرجعية التي تشترطها سلسلة ISO 16140 لاستخدامها بدلًا منها. وإذا لم تكن مصفوفة المخطط بين المصفوفات المعلنة، يُستحسن تأكيد النطاق مع TAAG قبل المشاركة.