جزء من محور الأساسيات والتوحيد القياسي في مركز التعلّم من TAAG. يتوسّع في نقطة ذكرناها في الاعتماد وفق ISO/IEC 17025 ويستند إلى الاستزراع الميكروبيولوجي التقليدي.
فهرس المقال
وسط الاستزراع نفسه يُخضَع للتحليل أيضًا
عندما يُبلغ المختبر عن «Salmonella: غير مكتشفة» أو عن عدّ للمعوّيات، فإنه يفترض أن الوسط الذي زُرعت عليه العينة كان يعمل كما ينبغي. فإذا كانت دفعة من الأجار الانتقائي تثبّط الكائن الدقيق المطلوب أيضًا، أو تسمح بنمو الفلورا المرافقة التي كان يُفترض أن تكبحها، فإن النتيجة تأتي خاطئة حتى لو أدّى المحلّل كل شيء على الوجه الصحيح. ولهذا يوجد في علم الأحياء الدقيقة للأغذية معيار مخصص للأوساط وحدها: ISO 11133.
تلخّص مقدمته الهدف في ثلاث أفكار: إثبات أن كل دفعة من الوسط مقبولة، وأن الوسط ملائم للاستخدام المقصود، وأنه يعطي نتائج متسقة. وهذه، بحسب المعيار نفسه، جزء أساسي من المراقبة الداخلية للجودة في المختبر.
ما هو ISO 11133 ولمن ينطبق
الطبعة السارية، ISO 11133:2014، حلّت محل المواصفتين الفنيتين ISO/TS 11133-1:2009 وISO/TS 11133-2:2003، وأضافت الأوساط المستخدمة في تحاليل المياه. وهي تعرّف مصطلحات ضمان جودة الأوساط، وتحدد متطلبات تحضيرها، وتصف طرق ومعايير تقييم أدائها. وتغطي الأوساط المستخدمة لتحليل الأغذية والأعلاف وعينات بيئة الإنتاج ومياه الشرب أو المياه المستخدمة في تصنيع الأغذية.
وينطبق على من يصنّعون أو يوزّعون الأوساط المجففة أو الجاهزة للاستخدام، وعلى الجهات غير التجارية التي تورّدها للغير، وعلى المختبرات التي تحضّر أوساطها بنفسها. وقد أضاف التعديل 1 لعام 2018 صراحةً المستخدمين النهائيين للأوساط الجاهزة: فشراء أطباق مُحضَّرة لا يعفي المختبر من مراقبتها.
تعديلان وطبعة جديدة في الطريق
- التعديل 1 (2018): تصويبات وإيضاحات، منها مستويات اللقاح في اختبارات الأداء.
- التعديل 2 (2020): أضاف الملحق K، الذي يتضمن سلالات المراقبة للأوساط والكواشف الخاصة بالتأكيد والتوصيف.
- الطبعة الثانية: مشروع ISO/FDIS 11133، الذي سيُعاد تسميته «أوساط الاستزراع والكواشف»، في مرحلة التصويت النهائية في ISO، وسيحلّ محل طبعة 2014 عند نشره.
وتوضح اللجنة ISO/TC 34/SC 9 كذلك أن المعايير الخاصة بكل كائن دقيق والمنشورة بعد عام 2014 والتي تتضمن فقرتها الخاصة باختبارات الأداء تُقدَّم على ما ينص عليه ISO 11133:2014 بالنسبة لتلك الأوساط.
الخصائص الثلاث التي تُقيَّم
الإنتاجية
هي مستوى استرداد الكائن الدقيق المستهدف في الوسط ضمن ظروف محددة. وتجيب عن أبسط الأسئلة: إن كان الكائن الدقيق موجودًا، فهل يسمح له الوسط بالنمو؟
الانتقائية
هي درجة تثبيط كائن دقيق غير مستهدف في وسط انتقائي. فالأجار الخاص بـSalmonella الذي يسمح لـEscherichia coli بالنمو بحرية ينتج أطباقًا مشبعة تضيع فيها المستعمرات النموذجية.
النوعية (الانتخابية)
هي إثبات أن الكائنات الدقيقة غير المستهدفة، إن نمت، لا تُظهر الخصائص البصرية نفسها التي تُظهرها الكائنات المستهدفة: اللون أو الهالة أو الشكل الذي يعتمد عليه المحلّل للتعرف على مستعمرة مشتبه بها. وفي الأوساط الكروموجينية هي الخاصية التي تمنع الخلط بين مستعمرة وأخرى.
كيف تُختبر
الاختبار الكمي ونسبة الإنتاجية
بالنسبة للأوساط الصلبة المخصصة للعدّ، يقارن المعيار النمو في الوسط قيد الاختبار بالنمو في وسط مرجعي، عادةً غير انتقائي، مثل أجار التربتون والصويا (TSA). والنتيجة هي نسبة الإنتاجية، PR = NS/N0: أي العدّ في الوسط قيد الاختبار مقسومًا على العدّ في الوسط المرجعي. ويحدد التعديل 1 اللقاح بنحو 100 CFU لتحقيق دقة كافية، بمدى عملي يتراوح بين 80 و120 CFU لكل طبق وحدّ أدنى قدره 50.
والمعيار المعتاد هو PR لا يقل عن 0,5 للأوساط الانتقائية ولا يقل عن 0,7 للأوساط غير الانتقائية. ومثال محدد من المعيار: يُختبر أجار TBX الخاص بـE. coli الموجبة لإنزيم β-غلوكورونيداز بسلالات من E. coli، ويُقارن بـ TSA، ويجب أن يعطي PR ≥ 0,5 مع مستعمرات زرقاء.
الاختبارات النوعية
في الأوساط السائلة وبعض الأوساط الصلبة تُعبَّر النتيجة بمقياس بسيط: 0 (لا نمو أو لا عكارة)، 1 (نمو ضعيف)، 2 (نمو جيد). وبالنسبة للانتقائية، يشترط التعديل 1 تلقيح ما لا يقل عن 104 CFU من الكائن غير المستهدف؛ وبالنسبة للنوعية على الأطباق، ما لا يقل عن 103 CFU.
مرقات الإثراء الانتقائي
تُختبر المرقات مثل RVS الخاصة بـSalmonella بتلقيح الكائن المستهدف أو غير المستهدف أو خليط منهما، ثم تخطيطها على وسط عزل (مثل XLD) وعلى وسط غير انتقائي. وتُعدّ انتقائية المرق مرضية إذا لم يكن هناك نمو للكائن غير المستهدف على الطبق غير الانتقائي، أو كان أقل من 10 أو أقل من 100 CFU، بحسب ما يحدده الملحق المعني أو المعيار النوعي. وهو المبدأ نفسه الذي يحسم نجاح الإثراء الميكروبيولوجي في عينة حقيقية.
الأوساط متعددة الأغراض وأوساط التأكيد
بالنسبة لوسط متعدد الاستخدامات، مثل ماء الببتون المنظَّم (BPW)، يطلب التعديل 1 اختبارًا واحدًا على الأقل للإثراء المسبق بممرض ذي صلة بالمختبر، مثل Salmonella. أما في أوساط وكواشف التأكيد (الملحق K) فيكون الاختبار نوعيًا لأنه ينطلق من مستعمرة معزولة: يُحضَّن الشاهد الموجب للمدة الدنيا التي يسمح بها المعيار، والسالب للمدة القصوى. وبهذا يُتحقَّق من أن الموجب يظهر في الوقت المناسب وأن السالب لا يتغير لونه بسبب الإفراط في التحضين. ويُشرح تأكيد المستعمرات المشتبه بها في مقال النتيجة المبدئية والنتيجة المؤكَّدة.
سلالات المراقبة: لماذا يهمّ رقم WDCM
لا يمكن مقارنة اختبار الأداء بين المختبرات إلا إذا استخدمت جميعها سلالات متكافئة. ويحدد ISO 11133 سلسلة دقيقة:
- السلالة المرجعية: تُستلم مباشرة من مجموعة ميكروبية عضو في الاتحاد العالمي لمجموعات الاستزراع (WFCC) أو في المنظمة الأوروبية ECCO، ومحددة الهوية على الأقل حتى مستوى الجنس والنوع.
- المخزون المرجعي: مزارع متطابقة يُحصل عليها بزرعة ثانوية واحدة من السلالة المرجعية.
- المزرعة المخزّنة: زرعة ثانوية أولية من المخزون المرجعي.
- المزرعة العاملة: التي تُستخدم في الاختبار، وتُستمد من المخزون المرجعي أو من المزرعة المخزّنة أو من مادة مرجعية.
ترقّم كل مجموعة سلالاتها على طريقتها، فتحمل السلالة نفسها رموزًا مختلفة في كل فهرس. وقد حلّ المركز العالمي لبيانات الكائنات الدقيقة (WDCM) هذه المشكلة بمعرّف فريد: فهرس السلالات المرجعية WDCM. فمثلًا، يقابل WDCM 00031 السلالة Salmonella Typhimurium NCTC 12023 في المجموعة البريطانية.
مثال من القائمة الرسمية
تنشر اللجنة ISO/TC 34/SC 9 قائمة بسلالات المراقبة لكل وسط وكاشف في معاييرها؛ والطبعة الرابعة صدرت في مايو 2025. وبالنسبة لأجار XLD في ISO 6579-1، تذكر القائمة Salmonella Enteritidis WDCM 00030 أو Typhimurium WDCM 00031، وE. coli WDCM 00012 أو 00013، وEnterococcus faecalis WDCM 00009 أو 00087. وتنبّه ملاحظة إلى أن بعض اللوائح الوطنية قد تشترط نمطًا مصليًا آخر من Salmonella، وتشير علامة أخرى بالحرف «b» إلى السلالات التي يجب استخدامها كحد أدنى.
ما وراء الاختبار الميكروبيولوجي
تبدأ مراقبة الوسط قبل الزرع. فيشترط ISO 11133 أن يوثّق المصنّع، ضمن بيانات أخرى، اسم الوسط ومكوّناته، والنشرة الفنية، ورقم الدفعة، ودرجة الحموضة المستهدفة للوسط الكامل، وشروط التخزين، وتاريخ انتهاء الصلاحية. وعلى المختبر الذي يحضّر أوساطه بنفسه أن يعتني أيضًا بالماء والوزن والتعقيم ودرجة الحموضة النهائية والتخزين؛ ويكمل ISO 7218:2024 هذه المتطلبات العامة لمختبر الأحياء الدقيقة.
ويتناغم كل هذا مع ISO/IEC 17025، الذي يلزم بضمان ملاءمة المنتجات الموردة من الخارج ومراقبة صحة النتائج. والدفعة التي تفشل في المراقبة هي عمل غير مطابق: ويجب تقييم أي تحاليل ربما تأثرت، كما نوضح في مقال الاعتماد وفق ISO/IEC 17025. وفي الطرق الجزيئية المنطق نفسه، مع ضوابط خاصة بها، نشرحها في مقال ضوابط تفاعل PCR.
أخطاء شائعة
- قبول شهادة المورّد كضابط وحيد، دون التحقق من الدفعة داخل المختبر.
- استخدام سلالات مجموعات ميكروبية مُعاد زرعها دون تسجيل، بحيث يتعذر تتبع أصلها حتى السلالة المرجعية.
- اختبار الإنتاجية بلقاحات عالية جدًا تُخفي تثبيطًا جزئيًا للوسط.
- مراقبة الإنتاجية ونسيان الانتقائية أو النوعية في الأوساط الانتقائية والكروموجينية.
- إغفال أن المعيار الخاص بالكائن الدقيق قد يحدد سلالات ومعايير خاصة به تُقدَّم على ISO 11133.
الخلاصة
وسط الاستزراع كاشف له أداء قابل للقياس، وليس مادة محايدة. وينظّم ISO 11133 كيفية إثبات ذلك: إنتاجية مقارنةً بوسط مرجعي، وانتقائية بلقاحات عالية من الكائنات غير المستهدفة، ونوعية في الأوساط التفريقية، وسلالات مراقبة يمكن تتبعها بأرقام WDCM. ومراقبة كل دفعة، وتسجيل سلسلة الزرعات الثانوية، ومراجعة ما يشترطه معيار كل كائن دقيق، تمنع أن تعتمد النتيجة على دفعة معيبة دون أن يدري أحد.
عن TAAG
تعرّف على كيفية استكمال TAAG لعمل مختبر الاستزراع بأطقم كشف جزيئي تتضمن ضوابط التفاعل الخاصة بها.
الأسئلة الشائعة
ما هو ISO 11133؟
هو المعيار الدولي الذي يحدد كيفية تحضير أوساط الاستزراع المستخدمة في الأحياء الدقيقة للأغذية والأعلاف وبيئة الإنتاج والمياه وإنتاجها وتخزينها ومراقبة أدائها. والطبعة السارية هي طبعة 2014، مع تعديلين صدرا عامي 2018 و2020.
ما الفرق بين الإنتاجية والانتقائية والنوعية في الوسط؟
تقيس الإنتاجية مقدار ما يسترده الوسط من الكائن الدقيق المستهدف. وتقيس الانتقائية مقدار تثبيطه للكائنات غير المستهدفة. وتُثبت النوعية أن الكائنات غير المستهدفة التي تنمو لا يمكن الخلط بينها وبين المستهدف بصريًا.
ما هو رقم WDCM؟
هو معرّف فريد يمنحه المركز العالمي لبيانات الكائنات الدقيقة للسلالات الموصى بها في مراقبة الجودة. ويتيح معرفة أن سلالات تحمل رموزًا مختلفة في مجموعات مختلفة هي في الواقع السلالة نفسها.
هل يجب على المختبر الذي يشتري أطباقًا جاهزة للاستخدام أن يراقبها؟
نعم. فقد أدرج التعديل 1 لعام 2018 صراحةً المستخدمين النهائيين للأوساط الجاهزة ضمن نطاق ISO 11133، كما يشترط ISO/IEC 17025 التحقق من ملاءمة المستلزمات الموردة من الخارج.