جزء من محور الأسس والتوحيد القياسي في مركز التعلّم من TAAG. ويكمّل الدليل الخاص بـ اعتماد AOAC-PTM والدليل الخاص بـ الاستزراع الميكروبيولوجي التقليدي.
فهرس المقال
سؤالان مختلفان عن الطريقة نفسها
قبل استخدام طريقة ميكروبيولوجية في العمل الروتيني، يجب على المختبر أن يجيب عن سؤالين. الأول: هل تعمل الطريقة؟ أي هل تكشف الكائن الدقيق المستهدف أو تقيس كميته بأداء مقبول مقارنةً بمرجع معترف به. والثاني: هل تعمل بين يديه، بكوادره ومعداته والأغذية التي يحلّلها كل يوم؟ والسؤال الأول تجيب عنه المصادقة (validation)، والثاني التحقق (verification).
هذا التمييز ليس تفصيلًا تقنيًا. فالمعيار ISO/IEC 17025:2017، الذي يحكم كفاءة مختبرات الفحص، يشترط أن يتحقق المختبر من قدرته على تطبيق الطريقة تطبيقًا صحيحًا قبل إدخالها، بإثبات بلوغه الأداء المطلوب والاحتفاظ بالسجلات. وطريقة مصادَق عليها لم يتحقق منها أحد في المختبر الذي يستخدمها تترك ثغرة تظهر عادةً في التدقيقات. وتُشرح متطلبات الاعتماد في مقالة ISO/IEC 17025 في مختبرات الأغذية.
المصادقة: تحديد أداء الطريقة
تتمثل المصادقة في تحديد خصائص أداء الطريقة وتقديم دليل موضوعي على أنها تستوفي متطلبات استخدام مقصود. وفي ميكروبيولوجيا الأغذية يعني ذلك، في الغالب، مقارنة طريقة بديلة (مثل مجموعة PCR أو وسط كروموجيني) بطريقة مرجعية، هي عادةً بروتوكول استزراع تقليدي معياري مثل ISO 6579-1 لكشف Salmonella.
سلسلة ISO 16140
استبدلت اللجنة التقنية ISO/TC 34/SC 9 المعيار القديم ISO 16140:2003 بسلسلة من المعايير، كل منها مخصص لسيناريو مختلف:
- ISO 16140-1:2016: مصطلحات المصادقة المشتركة.
- ISO 16140-2:2016: بروتوكول المصادقة على الطرق البديلة، التجارية في معظمها، مقابل طريقة مرجعية. وله تعديل نُشر عام 2024 راجع جزءًا من الحسابات.
- ISO 16140-3:2021: بروتوكول التحقق، في مختبر واحد، من الطرق المرجعية والطرق البديلة المصادَق عليها مسبقًا.
- ISO 16140-4: المصادقة في مختبر واحد. ولا تصلح نتائجها إلا للمختبر الذي أجرى الدراسة.
- ISO 16140-5: المصادقة العاملية بين المختبرات للطرق غير التجارية، بعدد مختبرات مشاركة أقل مما في الجزء 2.
- ISO 16140-6:2019: المصادقة على الطرق البديلة للتأكيد والتنميط، التي تنطلق من مستعمرة مشتبه فيها لا من عينة غذاء.
وتكتمل السلسلة بالمعيار ISO 17468، الذي يحدد المتطلبات التقنية لوضع طريقة مرجعية معيارية أو مراجعتها.
ماذا تتضمن المصادقة وفق ISO 16140-2
للبروتوكول مرحلتان. الأولى دراسة مقارنة تُجرى في مختبر منظِّم: تُحلَّل عينات ملوثة بالطريقتين لقياس الحساسية، ويُحدَّد مستوى الكشف النسبي (RLOD)، ويُتحقَّق من الشمولية والاستبعادية بـ 50 سلالة من الكائن المستهدف و30 سلالة غير مستهدفة. وفي الطرق الكمية، تقيّم الدراسة المقارنة الصدق النسبي وملف الدقة. والمرحلة الثانية دراسة بين المختبرات، تحلّل فيها عدة مختبرات العينات نفسها لتقدير قابلية الطريقة لإعادة الإنتاج.
ويعتمد نطاق المصادقة على فئات الأغذية المدروسة. ولإعلان صلاحية طريقة لـ «مجموعة واسعة من الأغذية» يجب تغطية خمس فئات على الأقل. وهذا الإعلان عن النطاق هو أول ما ينبغي مراجعته في أي شهادة.
من يمنح الشهادة
في أوروبا، تصدر هيئات مستقلة مثل MicroVal وNF Validation (AFNOR) وNordVal (NMKL) شهادات مبنية على ISO 16140-2 وتنشر التقارير في مواقعها. وفي الولايات المتحدة، المخطط الأكثر انتشارًا هو مخطط AOAC International، الذي شرحناه في الدليل الخاص بـ اعتماد AOAC-PTM.
ماذا تقول اللائحة الأوروبية
تنص اللائحة (EC) 2073/2005 في مادتها الخامسة على أن الطرق التحليلية في المرفق الأول هي الطرق المرجعية، وأن استخدام الطرق البديلة مقبول حين تكون مصادَقًا عليها مقابل ذلك المرجع، وحين تكون تجارية، معتمَدة من طرف ثالث وفق بروتوكول EN ISO 16140 أو بروتوكولات مماثلة مقبولة دوليًا. وأضافت اللائحة (EU) 2019/229 تعريفات رئيسية: ما المقصود بـ «مجموعة واسعة من الأغذية» وما هي جهة الاعتماد المستقلة عن صانع الطريقة.
التحقق: إثبات أن الطريقة تعمل في مختبرك
يعرّف ISO 16140-3 التحقق بأنه إثبات أن طريقة مصادَقًا عليها تعمل بين يدي المستخدم وفق مواصفات مصادقتها. ويقسّم العملية إلى مرحلتين.
المرحلة 1: التحقق من التنفيذ
يثبت المختبر أنه يعرف تنفيذ الطريقة باستخدام غذاء واحد، يُختار من بين الأغذية التي دُرست في المصادقة. فإذا جاءت النتائج مشابهة لنتائج المصادقة، فقد حُلّت المشكلة الجوهرية (التقنية).
المرحلة 2: التحقق من أغذية المختبر
بعد ذلك يثبت المختبر أن الطريقة تعمل مع الأغذية التي يعلن أنه يحلّلها. ولذلك يختار غذاءً «صعبًا» من كل فئة مشمولة في نطاقه: منتجات ذات نشاط مائي منخفض، أو ذات مضادات ميكروبية طبيعية مثل التوابل، أو بها ليسيثين، أو كثيرة الدهون. ويعرض دليل التدريب الصادر عن لجنة ISO نفسها أمثلة مثل الآيس كريم وبيض البودرة واللحم المتبَّل ومسحوق الكاكاو.
ما الذي يُقاس وبأي معيار قبول
الطرق النوعية: eLOD50
في طرق الكشف يُقدَّر مستوى الكشف عند 50 % (eLOD50): أي التلوث الذي تعطي عنده الطريقة نتيجة إيجابية في نصف الحصص المحلَّلة. ويسمى «مقدَّرًا» لأن عدد العينات أقل بكثير مما في مصادقة كاملة. ومعيار القبول هو ألّا يتجاوز eLOD50 المتحصَّل عليه أربعة أمثال LOD50 الخاص بالمصادقة. ففي مثال دليل التدريب الصادر عن ISO لـ Salmonella وفق ISO 6579-1، كان LOD50 المرجعي 5.7 CFU، وكان الحد 22.8 CFU، وحصل المختبر على 3.0 CFU، وبذلك استوفى المعيار. ويُشرح مفهوم LOD50 في مقالة حد الكشف وعدم اليقين في القياس.
الطرق الكمية: قابلية إعادة الإنتاج والانحياز
في العدّ، يقيس التحقق من التنفيذ الانحراف المعياري لقابلية إعادة الإنتاج داخل المختبر (SIR)، بتصميم متوافق مع ISO 19036. والمعيار ألّا يتجاوز ضعف أدنى قيمة متوسطة لقابلية إعادة الإنتاج متحصَّل عليها في المصادقة. أما التحقق من الأغذية فيقيس الانحياز المقدَّر (eBias): تُلوَّث حصص عند ثلاثة مستويات، بالتكرار المزدوج، ويجب ألّا يتجاوز الفرق عن المستوى المتوقع 0.5 log10 في أي مستوى.
طرق التأكيد والتنميط
يُشترط هنا التحقق من التنفيذ فقط: تُختبر سلالات مستهدفة وغير مستهدفة (في مثال الدليل، خمس من كل نوع) ويُشترط توافق بنسبة 100 % مع النتيجة المتوقعة.
مهلة 2028 للطرق المرجعية غير المصادَق عليها
نُشرت معايير ISO مرجعية كثيرة دون بيانات أداء. ولها يتيح ISO 16140-3 بروتوكولًا انتقاليًا في ملحقه F. ووفقًا لوثيقة الانتقال الصادرة عن لجنة ISO، يمكن استخدام هذا الملحق حتى 31 ديسمبر 2027؛ ومنذ 1 يناير 2028، لن يمكن التحقق وفق ISO 16140-3 إلا من الطرق المرجعية المصادَق عليها. ومعايير ISO طوعية، لكن هيئات الاعتماد كثيرًا ما تتخذها معيارًا.
وتوضح الوثيقة نفسها متى يجب إعادة التحقق. فالطريقة المعتمَدة بالفعل لا تحتاج إلى تحقق جديد ما لم تتغير. أما الطريقة الجديدة أو فئة أغذية جديدة ضمن النطاق فتحتاج إليه. وإذا شهدت طريقة مصادَق عليها تغييرًا تقنيًا كبيرًا ذا أثر ملحوظ، فكذلك.
إذا لم يستوفِ التحقق المعيار
يطلب المعيار تحليل السبب الجذري قبل التكرار. والأسباب المعتادة هي تحضير اللقاح ومستواه، وتجانس العينة، ومعايرة المعدات، ودفعات الأوساط أو الكواشف، وتطبيق المحلِّل للبروتوكول. وإذا استمرت المشكلة، فالخطوة التالية استشارة مورّد الطريقة (إن كانت تجارية)، أو هيئة التوحيد القياسي (إن كانت مرجعية)، أو جهة الاعتماد.
أخطاء شائعة
- افتراض أن شهادة المصادقة تحل محل التحقق في المختبر.
- تطبيق الطريقة على أغذية من فئة ليست ضمن نطاق مصادقتها.
- التحقق بغذاء «سهل» فقط، وليس بغذاء يمثل الصعوبات الفعلية للمختبر.
- عدم الاحتفاظ بسجلات التحقق، وهي مطلوبة بموجب ISO/IEC 17025.
- تغيير مرحلة في البروتوكول، مثل زمن الإثراء، ومواصلة معاملة الطريقة على أنها مصادَق عليها.
الخلاصة
المصادقة والتحقق يجيبان عن سؤالين مختلفين: هل تعمل الطريقة، وهل تعمل في مختبرك. وتنظّم سلسلة ISO 16140 العمليتين، من المصادقة على الطرق البديلة وفق ISO 16140-2 إلى التحقق في مختبر واحد وفق ISO 16140-3، بمعايير قبول محددة مثل eLOD50 أو eBias. ومراجعة نطاق الشهادة، والتحقق بأغذية ممثِّلة، والاحتفاظ بالسجلات، تمنع أن تتحول طريقة جيدة المصادقة إلى نقطة ضعف في المختبر.
عن TAAG
تعرّف على كيف توثّق TAAG النطاق المصادَق عليه لمجموعات الكشف الجزيئي لديها لتيسير التحقق منها في مختبر كل عميل.
الأسئلة الشائعة
ما الفرق بين المصادقة على طريقة ميكروبيولوجية والتحقق منها؟
تحدد المصادقة أداء الطريقة وتثبت أنها تصلح لاستخدام مقصود، عادةً بمقارنتها بطريقة مرجعية. أما التحقق فيثبت أن مختبرًا بعينه يحصل على ذلك الأداء عند تطبيقها بمعداته وكوادره وأغذيته.
هل تحتاج طريقة حاصلة على شهادة MicroVal أو NF Validation أو AOAC إلى التحقق؟
نعم. فالشهادة تدعم الطريقة، لكن ISO/IEC 17025 يشترط أن يتحقق كل مختبر من قدرته على تطبيقها تطبيقًا صحيحًا قبل استخدامها، ويصف ISO 16140-3 كيفية ذلك.
ما هو eLOD50؟
هو مستوى الكشف عند 50 % المقدَّر أثناء التحقق من طريقة نوعية: أي التلوث الذي تكشف عنده الطريقة الكائن الدقيق في نصف الحصص المحلَّلة. ويقبل ISO 16140-3 النتيجة إذا لم تتجاوز أربعة أمثال LOD50 المتحصَّل عليه في المصادقة.
ماذا عن الطرق المرجعية ISO التي لا تتوافر لها بيانات مصادقة؟
حتى 31 ديسمبر 2027 يمكن التحقق منها بالبروتوكول الانتقالي في الملحق F من ISO 16140-3. ومنذ 1 يناير 2028، لن يمكن التحقق وفق هذا المعيار إلا من الطرق المرجعية المصادَق عليها.