العدد الأكثر احتمالًا (MPN): كيف يعمل، وكيف تُقرأ جداوله، ومتى يُفضَّل على العد في الأطباق

العد دون رؤية المستعمرات

يعدّ العد في الأطباق ما يُرى: فكل مستعمرة على الآغار تُعدّ وحدة تشكيل مستعمرة واحدة، كما هو مشروح في ما وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) وكيف تُفسَّر. أما طريقة العدد الأكثر احتمالًا (MPN، اختصارًا لتسميتها الإنجليزية Most Probable Number) فتصل إلى الرقم بطريق آخر. فهي لا تعدّ المستعمرات، بل توزّع العينة على عدة أنابيب تحتوي مرقًا، وترصد أيها يُظهر نموًا، ثم تحسب من هذا المزيج من النتائج الموجبة والسالبة التركيزَ الذي يُرجَّح أكثر من غيره أنه أنتج تلك النتيجة.

ينسب الملحق 2 من الدليل البكتريولوجي التحليلي (BAM) الصادر عن FDA إلى McCrady، عام 1915، أول تقدير دقيق للبكتيريا الحية بهذه الطريقة. ولا تزال الطريقة مستخدمة لأنها تحل حالات يخفق فيها الطبق: التراكيز المنخفضة، والأغذية التي تحتوي جسيمات تُخلط بالمستعمرات، والكائنات الدقيقة التي تحتاج إلى إثراء قبل أن يمكن عزلها.

المبدأ الإحصائي

الفكرة هي التخفيف إلى أن يتلقى بعض الأنابيب خلية حية واحدة على الأقل ولا يتلقى بعضها الآخر أي خلية. فإذا كانت البكتيريا موزعة عشوائيًا، فإن عدد الخلايا الذي يقع في كل أنبوب يتبع توزيع بواسون، ولا يتوقف احتمال أن يبقى أنبوب بلا خلايا إلا على التركيز وكمية العينة الملقَّحة. ومع عدة تخفيفات عشرية وعدة أنابيب لكل تخفيف، يتيح نمط الأنابيب الموجبة تقدير التركيز الأصلي. فالـ MPN هو، حرفيًا، قيمة التركيز التي تجعل النتيجة المرصودة الأكثر احتمالًا؛ وتُحل المعادلة بالتكرار.

الافتراضات الواجب تحققها

يعدّد BAM أربعة شروط لكي يكون التقدير صحيحًا:

• البكتيريا موزعة عشوائيًا في العينة.
• الخلايا منفصلة غير متكتلة، ولا يتنافر بعضها مع بعض.
• كل أنبوب يتلقى ولو كائنًا حيًا واحدًا يُظهر نموًا أو تغيرًا قابلًا للرصد.
• الأنابيب مستقلة بعضها عن بعض.

الافتراض الثالث هو الأكثر تطلبًا: إذ يجب أن يسمح الوسط بنمو خلية واحدة، متضررة أحيانًا، في مواجهة الفلورا المرافقة. ولذلك تحدد جودة المرق ومرحلة الإثراء النتيجة مباشرة. كما أن MPN لا يعدّ إلا الكائنات الحية. وإذا شكّلت البكتيريا سلاسل أو تجمعات لا يفصلها التخفيف، يشير BAM إلى أن النتيجة يجب أن تُقرأ بوصفها وحدات نمو أو CFU، لا خلايا منفردة.

سلاسل من 3 و5 و10 أنابيب

التصميم الأكثر انتشارًا هو ثلاثة تخفيفات عشرية متتالية بـ 3 أو 5 أو 8 أو 10 أنابيب لكل منها؛ ويتضمن الملحق 2 جداول لهذه التصاميم، أُعدّت للقاحات قدرها 0,1 و0,01 و0,001 غ. ويشير الفصل 4 من BAM، الخاص بالقولونيات وE. coli، إلى أن سلسلة 3 أنابيب تُستخدم لمعظم الأغذية؛ وأنه لا ينبغي استخدام أقل من 5 أنابيب لكل تخفيف في الرخويات ذوات المصراعين؛ وأن هناك طريقة بـ 10 أنابيب للمياه المعبأة أو للعينات التي لا يُتوقع أن تكون شديدة التلوث.

المزيد من الأنابيب يعني معلومات أكثر لكل تخفيف، ومن ثم فترات أضيق وحدًا أدنى أخفض. فبجداول BAM واللقاحات 0,1 و0,01 و0,001 غ، تُبلَّغ النتيجة التي تكون فيها كل الأنابيب سالبة بأنها أقل من 3,0 MPN/غ في سلسلة 3 أنابيب، وأقل من 1,8 MPN/غ في سلسلة 5 أنابيب. وينخفض الحد الأعلى لفترة الثقة لهذه النتيجة الصفرية من 9,5 إلى 6,8، ثم إلى 3,1 MPN/غ مع 10 أنابيب.

كيف تُقرأ الجداول

يُعبَّر عن النتيجة برمز من ثلاثة أرقام: عدد الأنابيب الموجبة في كل من التخفيفات الثلاثة المختارة. ففي جدول 3 أنابيب، يقابل الرمز 3-1-0 قيمة 43 MPN/غ، بفترة ثقة 95 % من 9 إلى 180. وإذا كانت اللقاحات المستخدمة أصغر بعشر مرات من لقاحات الجدول (0,01 و0,001 و0,0001 غ)، تُضرب القيمة وحدودها في 10: أي 430 MPN/غ. وتنطبق القاعدة نفسها في الاتجاه المعاكس: فتلقيح كميات أكبر يخفض حد القياس الكمي.

عند زرع أكثر من ثلاثة تخفيفات، يصف BAM إجراءً لاختيار التخفيفات الثلاثة التي تُنقل إلى الجدول. وباختصار، تُستبعد التخفيفات الأعلى التي تكون كل أنابيبها سالبة هي والتخفيف السابق لها، ويُبحث عن أعلى تخفيف تكون كل أنابيبه موجبة. وتوفر FDA أيضًا تطبيقًا للحساب وجدول بيانات لاختيار التخفيفات.

تُسقط الجداول التوليفات البعيدة الاحتمال إلى حد يوحي بخطأ مخبري أو تلوث. فإذا لم يكن الرمز الناتج موجودًا في الجدول، يعامله BAM بوصفه نتيجة بعيدة الاحتمال: قد ترجع إلى تداخلات في التخفيفات المنخفضة أو إلى تأكيد عدد قليل من المستعمرات، وإذا لم يُعرف السبب فقد لا يكون التقدير موثوقًا.

فترات الثقة: الرقم يأتي مع نطاق واسع

يجب أن تُقرأ قيمة MPN دائمًا مع فترتها. ففي سلسلة 5 أنابيب، يعطي الرمز 5-2-0 قيمة 49 MPN/غ بفترة 95 % من 15 إلى 150: أي أن القيمة الحقيقية قد تقع في نطاق يغطي عاملًا يقارب العشرة. ويعرّف BAM هذه الفترة على النحو الآتي: قبل تلقيح الأنابيب، يكون احتمال أن تحتوي الفترة الناتجة التركيز الحقيقي 95 % على الأقل. وتستخدم الجداول تعديلًا لطريقة de Man (1983)؛ أما جدول بيانات Excel الصادر عن FDA فيستخدم تقريبًا طبيعيًا للوغاريتم MPN، لذا قد لا تتطابق فتراته مع فترات الجداول.

وصف عدد من الباحثين ميل MPN إلى المبالغة في تقدير التركيز. ويستشهد BAM بعمل Garthright (1993)، الذي أظهر أن هذا الانحياز لا يكون ملموسًا عندما يُعبَّر عن النتائج باللوغاريتمات، وهي الصيغة المعتادة لمقارنة البيانات وجمعها. ولفهم كيف تتضافر عدم اليقين وحد الكشف وقرار المطابقة، انظر حد الكشف وعدم اليقين في القياس.

أين يُستخدم MPN في صناعة الأغذية

القولونيات وE. coli في الأغذية

للطريقة الكلاسيكية في BAM ثلاث مراحل. في المرحلة الافتراضية، تُزرع التخفيفات في مرق لوريل تريبتوز (LST) وتُحضن عند 35 °C؛ ويُسجَّل إنتاج الغاز بعد 24 و48 ساعة. وفي المرحلة التأكيدية للقولونيات، ينتقل كل أنبوب فيه غاز إلى مرق الأخضر اللامع والصفراء واللاكتوز (BGLB) عند 35 °C، وللقولونيات البرازية وE. coli إلى مرق EC عند 44,5 °C. وتضيف المرحلة المكتملة لـ E. coli العزل على آغار L-EMB واختبارات كيميائية حيوية (IMViC). ويُحسب MPN من نسبة الأنابيب المؤكدة في ثلاثة تخفيفات متتالية. ويذكّر الفصل بأن القولونيات ليست فئة تصنيفية بل تعريف عملي. أما ما تدل عليه كل مجموعة في المياه فمشروح في القولونيات الكلية وE. coli والمكورات المعوية.

E. coli في الرخويات ذوات المصراعين: ISO 16649-3

هذه هي الحالة التي تكون فيها MPN الطريقة التي تحددها اللائحة. إذ تضع اللائحة (EC) رقم 2073/2005 للرخويات الحية ذوات المصراعين، ولشوكيات الجلد والغلاليات وبطنيات القدم البحرية الحية، معيار سلامة لـ E. coli قيمه n = 5 وc = 1 وm = 230 وM = 700 MPN لكل 100 غ من اللحم والسائل بين المصراعين، طوال مدة الصلاحية، مع EN/ISO 16649-3 طريقةً مرجعية. وتكون الدفعة مرضية إذا كانت القيم الخمس 230 أو أقل، أو إذا وقعت قيمة واحدة فقط بين 230 و700.

يصف البروتوكول العام لمركز المرجع التابع لـ FAO، المستند إلى ISO 16649-3، الطريقةَ بأنها MPN على مرحلتين بـ 5 أنابيب و3 تخفيفات. أولًا، يُزرع متجانس الرخويات في مرق الغلوتامات المعدني المعدَّل ويُحضن عند 37 °C لمدة 24 ساعة؛ ثم تُزرع الأنابيب التي أنتجت حمضًا زرعًا فرعيًا على آغار يحتوي ركيزة كروموجينية لإنزيم β-glucuronidase (TBX) عند 44 °C. والحد النظري للكشف هو 18 E. coli لكل 100 غ، ومع ثلاثة تخفيفات تكون أعلى نتيجة قابلة للإبلاغ أكبر من 18.000. ولا تُكشف السلالات السالبة لـ β-glucuronidase، مثل E. coli O157. وتشير الوثيقة نفسها إلى أن مواصفة Codex 292-2008 تحدد هذه الطريقة، أو طريقة مكافئة، للرخويات ذوات المصراعين الحية أو النيئة.

القياس الكمي للسالمونيلا في الذبائح وجلد الرقبة

بالنسبة إلى Salmonella، يجيب الكشف (الغياب في 25 غ) عن سؤال وجود الممرض؛ أما MPN فيجيب عن مقداره. وتصف المواصفة الفنية ISO/TS 6579-2:2012 طريقة MPN مصغّرة في أطباق من 12 حفرة: ثلاث حفر لكل تخفيف، وتخفيفات متتالية في ماء الببتون المنظَّم، وزرع فرعي في الوسط شبه الصلب MSRV عند 41,5 °C، مع التأكيد على آغار XLD. وتقرّ المواصفة بحدودها: فحد الكشف نحو 1 CFU/غ، مقابل 1 CFU في 25 غ (0,04 CFU/غ) في طريقة الكشف، وهي غير مناسبة للعينات التي تحتوي أقل من 1 CFU/غ، إذ توصي فيها بـ MPN تقليدي.

طبّقت دراسة نُشرت في Poultry Science عام 2024 طريقة MPN المصغّرة هذه على 96 عينة مركّبة من جلد الرقبة تمثل 480 ذبيحة دجاج. ووجدت Salmonella في 97,9 % من العينات قبل التبريد وفي 85,4 % بعده، بمتوسط عدّ قدره 1,84 و1,48 log MPN/غ. ولم تكن نتيجة الوجود لتُظهر هذا الانخفاض. ويفيد هذا النوع من القياس الكمي في تقييم مراحل العملية، كما يتضح في السالمونيلا في لحم الدجاج.

Listeria monocytogenes في العينات الموجبة

يطلب الفصل 10 من BAM تعداد L. monocytogenes عندما تكون نتيجة الغذاء موجبة، باستخدام جزء احتياطي والجمع بين MPN والزرع المباشر. ويُبنى MPN من 50 غ من العينة في 450 مل من مرق الإثراء المنظَّم لـ Listeria (BLEB) وأربعة تخفيفات بثلاثة أنابيب لكل منها، تعادل 10 و1 و0,1 و0,01 غ من العينة. وبعد 48 ساعة يُزرع كل أنبوب للعزل والتأكيد، أو يُفرز بطريقة سريعة معتمدة وتُؤكَّد النتائج الافتراضية؛ وتُفسَّر النتيجة بجداول الملحق 2. وإذا كانت كل الأنابيب موجبة، يُعتمد العد بالزرع المباشر.

MPN مقابل العد في الأطباق (CFU)

ليستا طريقتين متنافستين، بل أداتان لنطاقات ومصفوفات مختلفة:

• الحساسية في الأعداد المنخفضة. يشير BAM إلى أن MPN مفيدة بشكل خاص للتراكيز المنخفضة، الأقل من 100 لكل غرام، ولا سيما في الحليب والماء. فكل أنبوب يمكن أن يتلقى عدة غرامات، مما يخفض الحد الأدنى.
• المصفوفات الصعبة. في الأغذية التي تحتوي جسيمات تتداخل مع عد المستعمرات، يتجنب الأنبوب ذو المرق مشكلة التمييز بين المستعمرات وبقايا الغذاء.
• استعادة الخلايا المتضررة. يعمل المرق مرحلةَ نمو أولية، مما يفيد الخلايا المجهَدة بالحرارة أو البرودة أو المطهرات، شريطة أن يكون الوسط مناسبًا.
• الدقة. هي نقطة الضعف: ففترات MPN واسعة، بحيث إن نتيجتين تبدوان مختلفتين قد لا تختلفان إحصائيًا. والطبق المعدود جيدًا ضمن نطاقه المفيد أدق عمومًا.
• الجهد والوقت. أنابيب كثيرة، وعمليات نقل متعددة، وتأكيدات تستغرق 48 ساعة أو أكثر. ويكون الاستزراع التقليدي في الأطباق أكثر مباشرة إذا كان الحمل المتوقع مرتفعًا.
• التأكيد. في طرق الممرضات، يظل الأنبوب الذي يُظهر نموًا افتراضيًا إلى أن يُؤكَّد (انظر النتيجة الافتراضية مقابل المؤكدة).

ما مجموعات TAAG المرتبطة بهذه الطريقة

لا تملك TAAG مجموعة لطريقة MPN: فمجموعاتها للـ PCR في الوقت الحقيقي نوعية (كشف وتحديد هوية) ولا تعطي عددًا من الكائنات الدقيقة لكل غرام. أما الدور الذي قد تؤديه فهو في قراءة الأنابيب أو الحفر، كما يجيز الفصل 10 من BAM في MPN الخاص بـ Listeria. ويضم الكتالوج مجموعات للكائنات الدقيقة التي تُقاس كميًا بطريقة MPN: Specio 1.3 E. coli (V-SF167)، بمصفوفات معلنة تشمل الأغذية والمشروبات والأسطح الحية والخاملة؛ وAmpliora 1.3 E. coli (V-SF69)، للخضروات الورقية والأسطح؛ وAmpliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97)، بحساسية معلنة قدرها 1 CFU/25 غ في فخذ الدجاج النيء، والبرغر البقري المجمد، والنقانق (longanicilla)، والمرتديلا، والأسطح؛ وAmpliora 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF46)، للأغذية والمشروبات والأسطح. ولا تعلن أي منها الرخويات ذوات المصراعين مصفوفةً مُثبتة الصلاحية، كما أن أوساط الإثراء المرتبطة بها ليست مُرق طريقة MPN موحّدة (MMGM أو BLEB أو MSRV). واستخدام مجموعة لقراءة أنابيب MPN يتطلب التحقق من صلاحية هذا الاستخدام مع المرق والمصفوفة المعنيين؛ ويُستحسن مراجعة ذلك مع TAAG قبل إدراجها في إجراء.