من عينة المختبر إلى الجزء التحليلي: التحضير وفق ISO 6887 والمعلق الأولي وتجميع العينات للممرضات

الخطوة التي لا يراها أحد في التقرير

تُبلَّغ النتيجة الميكروبيولوجية بصيغة «غياب في 25 غ» أو «3.200 CFU/غ»، لكن بين الكيس الذي يصل إلى المختبر والطبق أو المرق مرحلة لا تكاد تظهر في التقرير: تحضير العينة. كم يُوزن، وفي أي مخفف، وكم يُجانَس، وكم ينتظر المعلق، وهل تُجمع الأجزاء: كل قرار يغيّر ما يعنيه الرقم. ويرد أخذ العينات في المصنع في أخذ العينات من الأسطح، والنقل إلى المختبر في نقل العينات وحفظها؛ ويبدأ هذا المقال حيث ينتهيان، والعينة قد استُلمت.

المرجع الدولي لهذه المرحلة هو سلسلة ISO 6887 الصادرة عن اللجنة ISO/TC 34/SC 9. وتتألف من ستة أجزاء: يضع الجزء 6887-1:2017 القواعد العامة، وتنزل الأجزاء الخمسة الأخرى إلى مجموعات المنتجات: اللحوم (6887-2:2017)، والأسماك ومنتجات الصيد (6887-3:2017)، ومنتجات متنوعة كالبيض والخضروات والكاكاو والأعشاب والتوابل (6887-4:2017)، والحليب ومنتجات الألبان (6887-5:2020)، وعينات الإنتاج الأولي من المزرعة إلى المسلخ (6887-6:2013). وإذا تضمنت الطريقة الخاصة بكائن دقيق تعليماتها الخاصة، فلها الأولوية.

المعلق الأولي 1:10 خطوة بخطوة

الوزن والنسبة

يطلب ISO 6887-1 وزن الجزء التحليلي أو قياسه بتفاوت ±5 %، بحد أدنى 10 غ أو 10 مل ما لم تنص الطريقة على غير ذلك، وإضافة 9 أضعاف هذه الكمية من المخفف، ويُفضَّل قياسه بالكتلة بتفاوت ±2 %. وهكذا يُحصل على التخفيف 1:10. ويقبل المعيار نسبًا أخرى عند الحاجة: 1 في 20 أو 1 في 50 أو 1 في 100 للمنتجات التي تعطي معلقات شديدة الكثافة، و1 في 2 أو 1 في 5 حين يُطلب عدّ منخفض، وإن كان يحذّر من أن هذه الأخيرة قد تُخل بالتوازن بين اللقاح والوسط ويجب التحقق منها حالةً بحالة. وأي نسبة غير قياسية تنتقل إلى الحساب النهائي.

المخففات

يعرّف المعيار للاستخدام العام مخففين: المحلول الملحي الببتوني (1 غ من هضيم الكازين الإنزيمي و8,5 غ من كلوريد الصوديوم لكل لتر) وماء الببتون المنظَّم، وكلاهما بدرجة pH نهائية 7,0 ± 0,2 عند 25 °م. وتوجد كذلك نسخة مضاعفة التركيز من ماء الببتون المنظَّم للمنتجات شديدة الحموضة. ولا يجوز أن ينحرف الحجم النهائي بأكثر من ±2 %، ويجب أن تجتاز المخففات اختبار أداء: فبعد 45 دقيقة إلى ساعة في درجة حرارة الغرفة، يجب أن يبقى عدّ السلالة الضابطة ضمن ±30 % من العدّ الأولي. وتُفصَّل متطلبات أداء المخففات والأوساط في ISO 11133.

التجانس

يُجانَس المزيج وفق ISO 7218 (الطبعة الرابعة، 2024)، بجهاز تجانس دوّار (خلاط مختبري) أو تمعجي، وهو جهاز المجاديف الذي يضرب كيسًا معقمًا ويُسمّى في المختبرات عادةً stomacher. وعند الحاجة تُترك الجسيمات الكبيرة لتترسب حتى 15 دقيقة؛ والأكياس ذات المرشح المدمج بديل مكافئ. وبالنسبة للمنتجات الصلبة أو الجافة، يحدّ المعيار تشغيل جهاز التجانس الدوّار بـ 2,5 دقيقة متواصلة، والفرم أو الطحن المسبق بدقيقة واحدة، لتجنب تسخين العينة. ويستخدم دليل FDA للأغذية (BAM، الفصل 1) للعدّ 50 غ من العينة في 450 مل من مخفف فوسفات Butterfield، تُخلط لمدة دقيقتين.

الأزمنة القصوى

ينص ISO 6887-1 على أنه لا يجوز أن تمر أكثر من 45 دقيقة بين نهاية تحضير المعلق الأولي وملامسة اللقاح لوسط الاستنبات النهائي، ولا أكثر من 30 دقيقة بين المعلق الأولي وبدء التخفيفات. وإذا كانت حرارة المختبر فوق 27 °م، ينبغي تقصير الزمنين. أما BAM فأكثر صرامة: لا أكثر من 15 دقيقة من التجانس حتى تصبح كل التخفيفات في أوساطها. ففي معلق غني بالمغذيات قد تبدأ الكائنات الدقيقة في التكاثر فتخرج النتيجة أعلى من العينة الحقيقية.

التخفيفات العشرية

في كل خطوة عشرية يُنقل 1 مل ± 0,02 مل إلى أنبوب يحوي 9 مل ± 0,2 مل من المخفف، دون إدخال الماصة أكثر من 1 سم، مع الخلط من 5 إلى 10 ثوانٍ واستخدام طرف جديد في كل خطوة.

القواعد بحسب نوع الغذاء

المجمَّدات

بالنسبة للعبوات الصغيرة (عمومًا أقل من 2 كغ)، يسمح ISO 6887-1 بإيصالها إلى قوام يتيح أخذ الجزء، عند 18-27 °م لمدة أقصاها 3 ساعات أو عند 5 ± 3 °م لمدة أقصاها 24 ساعة، ولا ينصح بالإذابة في حمام مائي أو تحت الماء الجاري، لخطر التلوث إذا لم تكن العبوة محكمة. ويفضّل BAM عدم الإذابة، وعند الحاجة يجريها عند 2-5 °م خلال 18 ساعة كحد أقصى، أو دون 45 °م لمدة لا تزيد على 15 دقيقة مع التحريك في حمام منظَّم الحرارة.

اللحوم

يغطي ISO 6887-2 اللحوم الطازجة والمبردة والمجمدة والمعالجة والمخمرة والمفرومة، ومستحضرات اللحوم، واللحم المفصول ميكانيكيًا، واللحوم المطهوة والمجففة والمدخنة، والمستخلصات المركزة، وعينات الذبائح المأخوذة بالاستئصال أو بالمسحة. ويميز، من بين حالات أخرى، بين الكتل والقطع، والنقانق بأغلفتها، وعينات السطح أو العمق. أما أخذ العينات من الذبيحة فموضوع ISO 17604. وسياق الصناعة في الميكروبيولوجيا في صناعة اللحوم.

الألبان

لـ ISO 6887-5 إجراءات خاصة للحليب السائل، والحليب ومصل اللبن المجففين، والأجبان، والكازينات والكازينات الملحية (مع حالة خاصة لكازين المنفحة)، والزبدة، والمثلجات، وحلويات الألبان ذات pH أعلى من 5، والألبان المخمرة والزبادي ذات pH أقل من 5، وحليب الرضع المجفف. ويوضح BAM لماذا لا يمكن معاملة كل شيء بالطريقة نفسها: فبالنسبة لـ Salmonella في الجبن يخلط 25 غ مع 225 مل من مرق اللاكتوز لمدة دقيقتين، ويتركه 60 دقيقة، ويضبط pH عند 6,8 ± 0,2؛ أما الحليب المجفف منزوع الدسم سريع الذوبان فيُسكب برفق على سطح المرق ويُحضن دون خلط.

الأسماك والمأكولات البحرية

يشمل ISO 6887-3 الأسماك الكاملة أو الفيليه، والقشريات، ورأسيات الأرجل، والرخويات ذات المصراعين، وبطنيات الأرجل، والغلاليات، وشوكيات الجلد، إضافةً إلى المدخنة والمطهوة والكتل المجمدة، ويتضمن إجراءات خاصة للرخويات والغلاليات وشوكيات الجلد النيئة من مناطق الإنتاج الأولي.

الأغذية الجافة والحمضية والدهنية

• منخفضة الرطوبة: يُوزن المخفف أولًا ثم يُضاف الجزء، لتقليل الصدمة الأسموزية، ويُترك للنقع حتى ساعة إذا كان المنتج صلبًا. ويضيف BAM للمساحيق أولًا نحو 15 مل من المرق، فيكوّن معلقًا خاليًا من التكتلات، ثم يكمل الحجم على دفعات.
• الحمضية: يجب أن يعود المعلق إلى pH 7,0 ± 0,5. ويكفي ماء الببتون المنظَّم للمنتجات ذات pH 4,5 أو أكثر؛ وبين pH 3,5 و4,5 يمكن استخدام النسخة مضاعفة التركيز، مع التحقق من pH في المرة الأولى.
• الدهنية (أكثر من 20 %): يمكن إضافة البوليسوربات 80 إلى المخفف، بين 1 و10 غ/لتر؛ ويكفي عمومًا 1 غ/لتر لكل 10 % من الدهن.
• التوابل المثبطة: يضيف BAM كبريتيت البوتاسيوم بنسبة 0,5 % للبصل والثوم المجففين، ويخفف البهار الحلو والقرفة والزعتر البري (الأوريغانو) إلى 1:100 والقرنفل إلى 1:1000، لأنه لا تُعرف طريقة لمعادلة أثرها.

المركبة والمجمَّعة: ليستا الشيء نفسه

جمع وحدات من الدفعة نفسها يوفر الجهد والكواشف. ويحدد التعديل 1 لعام 2024 على ISO 6887-1 مفهومين يُخلط بينهما عمليًا:

• العينة المركبة: تُمزج عدة وحدات ويُؤخذ من المزيج جزء بالحجم الذي تحدده الطريقة، مثل 25 غ. وتظل النتيجة معبَّرًا عنها في 25 غ.
• العينة المجمَّعة (pooling): تُجمع عدة وحدات أو أجزاء ويُحلَّل المزيج كله. ويُعبَّر عن النتيجة في الكتلة الإجمالية، مثل 100 غ أو 375 غ.

ويمكن التجميع خارج المختبر، بضم عينات فردية في عينة أكبر، أو داخله، بضم أجزاء في إثراء مسبق واحد كبير أو بضم مرق أُثري مسبقًا. وهناك قواعد ثابتة: للاختبارات النوعية فقط، وبوحدات من المنشأ نفسه فقط (الدفعة أو الشحنة نفسها)، ودون الجمع بين أسلوبين معًا، كأن تُجمَّع الأجزاء ثم تُجمَّع مرقها أيضًا.

25 غ أو 375 غ: ما الذي يتغير بتكبير الجزء

يأتي المخطط الكلاسيكي من BAM: يُؤخذ من كل وحدة عينة جزء قدره 25 غ، ويمكن ضم ما يصل إلى 15 جزءًا في عينة مركبة قدرها 375 غ تُحلَّل كاملةً مع الحفاظ على النسبة 1:9 (375 غ في 3.375 مل من المرق). ويتوقف عدد الوحدات على فئة الغذاء: 60 للفئة I (دون خطوة قاتلة ومخصص لكبار السن أو المرضى أو الرضع)، و30 للفئة II، و15 للفئة III، أي 4 أو 2 أو 1 عينة مركبة من 375 غ. ونتيجة موجبة واحدة ترفض الدفعة. ويستثني BAM من التركيب، من بين أمور أخرى، الحليب المجفف غير سريع الذوبان والحليب المجفف كامل الدسم.

ويضع تعديل 2024 شروطًا تقنية حتى لا يُخفي الحجم الكبير نتيجةً موجبة:

• يجب أن يكون مرق الإثراء المسبق مسخَّنًا مسبقًا إلى درجة حرارة الحضن.
• يجب معرفة المنحنى الحراري للحجم الكبير. فعلى سبيل مثال ISO 6579-1، الذي يدوم إثراؤه المسبق بين 16 و20 ساعة، يجب أن يُحفظ المزيج بين 34 °م و38 °م لمدة 16 ساعة على الأقل، وأن يُقلَّص الزمن اللازم لبلوغ هذه الحرارة.
• لا تُغيَّر نسبة العينة إلى المخفف في الطريقة المصادق عليها، إلا لزيادتها في المصفوفات المثبطة مثل مسحوق البصل والثوم والزعتر البري والفلفل وبعض أنواع الشاي والقهوة والخلطات المسبقة للفيتامينات أو المنتجات شديدة الملوحة.
• تُقسَّم عينة المختبر الأكبر من الحد الأقصى: فتُعالَج 750 غ جزأين من 375 غ.

وفوق ذلك، يجب أن يكون الحجم الأكبر مصادقًا عليه. فإذا صودق عليه في دراسة وفق ISO 16140-2 أو ISO 16140-5، لا يحتاج كل مختبر إلا إلى التحقق منه وفق ISO 16140-3 ضمن فئة الغذاء نفسها؛ وإلا فعليه أن يصادق عليه بنفسه ببروتوكول الملحق H من التعديل 1:2024 على ISO 16140-4، مثبتًا بمستوى الكشف النسبي (RLOD) أن LOD50 لا يسوء. وبعد المصادقة على 375 غ، يمكن استخدام أجزاء أصغر بالنسبة نفسها. وتُشرح هذه المفاهيم في المصادقة على الطرق والتحقق منها.

وتدعم الأدلة هذا النهج حين يُطبَّق جيدًا. فقد صادق Tomás Fornés وزملاؤه على تجميع الأجزاء حتى 375 غ لـ Salmonella بخمس طرق (الاستنبات وELISA وPCR في الزمن الحقيقي) في 23 غذاءً (الحلويات، وحليب الرضع، وأغذية الحيوانات الأليفة، والمشروبات المسحوقة، وغيرها). وفي 22 من 23 كان RLOD50 مقابل 25 غ مقبولًا (أقل من 2,5)، بشرط تسخين المرق مسبقًا واحترام زمن الحضن الأقصى. ويظهر التجميع أيضًا في اللوائح: إذ تطلب اللائحة (EC) رقم 2073/2005 ضم جلد عنق ثلاث ذبائح دواجن على الأقل من القطيع الأصلي نفسه في عينة قدرها 26 غ، وتجميع مسحات مواضع مختلفة من الذبيحة قبل التحليل. وكيف تُقرأ n وc في هذه الخطط في خطط أخذ العينات بالصفات، ولماذا تكون مرحلة المرق حاسمة في الإثراء الميكروبيولوجي.

ما مجموعات TAAG وأوساطها المرتبطة

المجموعة هي التي تحدد الجزء المصادق عليه. ففي كتالوج TAAG، تعلن Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04، RT-qPCR بتقنية AiGOR) حساسية قدرها 1 CFU/375 غ في الأغذية و1 CFU/عينة على الأسطح؛ وتشمل شهادة AOAC الخاصة بها أجزاء بوزن 375 غ من الشوكولاتة بنسبة 62 % كاكاو وعجينة الكاكاو والحليب المجفف منزوع الدسم والفول السوداني، وتعلن TAAG أيضًا مصفوفات مصادقًا عليها مثل الشوكولاتة المحشوة ولحم البقر المفروم (90 % لحم أحمر) وحبيبات علف الحيوانات والبيض السائل المبستر وأسطح الفولاذ المقاوم للصدأ. وتدرج بطاقة بياناتها المكمّل Potentia 1 Salmonella spp. (V-PET06)، وهو محفِّز نمو لماء الببتون المنظَّم. وتعلن Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97، PCR في الزمن الحقيقي) حساسية 1 CFU/25 غ، بمصفوفات مصادق عليها هي فخذ الدجاج النيئ وبرغر اللحم المجمد ونقانق من نوع لونغانيزا والمورتاديلا والأسطح، وترتبط بـ Augmentis 14 Universal Gram negative (V-FL46، قوارير سعة 225 مل، وهو حجم المرق لـ 25 غ بنسبة 1:10). واستخدام مجموعة بجزء أو مصفوفة أو مخطط تجميع مختلف عما هو معلن يستلزم التحقق أو المصادقة اللذين يطلبهما تعديل ISO 6887-1. وللاختيار بحسب المصفوفة، انظر كيف تختار مجموعة من TAAG.